Characterization of the second internal transcribed spacer ribosomal DNA of species of the genus Culex and Lutzia bigoti (Diptera, Culicidae)

Culex é o maior gênero da tribo Culicini, com 767 espécies descritas e inclui vetores de muitos arbovírus e filárias. Apesar disso, estudos sobre sua taxonomia e filogenia ainda são muito escassos. A identificação dos mosquitos, etapa fundamental para estudos epidemiológicos, ecológicos e genéticos, geralmente é feita com base nos caracteres morfológicos. Entretanto, muitas espécies de Culex são morfologicamente semelhantes, dificultando a identificação correta. Atualmente, técnicas moleculares são utilizadas em estudos de evolução e na distinção de espécies. Dessa forma, sequências de ITS2 do DNAr de 15 espécies do gênero Culex e uma do gênero Lutzia foram clonadas e sequenciadas, para examinar o nível de divergência genômica e verificar a aplicabilidade desse marcador em análises filogenéticas no grupo estudado. Três a sete clones por indivíduo foram sequenciados, gerando 144 sequências com comprimentos de 199 a 339 pb. Foi gerada topologia de distância pelo método de Neighbour-joining (NJ), com p-distance não corrigido. A matriz de distância gerada evidenciou a presença de variação intragenômica e intra-específica. Dos 31 espécimes clonados e sequenciados, apenas um de Culex (Culex) mollis apresentou todas suas sequências idênticas (5 clones), enquanto um exemplar de Culex (Cux.) coronator apresentou diferença na composição nucleotídica entre todos os seus clones (6 clones). Devido à presença de variabilidade intragenômica, optou-se por selecionar as cópias que seriam utilizadas nas análises de distância empregando a similaridade das estruturas secundárias do ITS2. Assim, foi possível eliminar as cópias mais divergentes e que apresentavam similaridade inferior a 75%. Apesar da heterogeneidade observada, as sequências geradas de indivíduos das mesmas espécies se agruparam e foi condizente com a atual classificação baseada em morfologia. A topologia de NJ indica a possível monofilia dos subgêneros Melanoconion e Microculex. No entanto, indica também o parafiletismo do gênero Culex em relação ao Lutzia e do subgênero Culex em relação ao Phenacomyia. O posicionamento de Lutzia dentro do grupo formado por espécies do gênero Culex indica que o atual status genérico do táxon não é sustentado pela análise de NJ do ITS2, assim, o mais apropriado seria Lutzia ser considerado subgênero de Culex. O posicionamento de Phenacomyia dentro do grupo do subgênero Culex indica que este táxon não pode ser considerado subgênero de Culex. Apesar da variabilidade intragênomica, o ITS2 parece ser marcador adequado à soluções de questões taxonômicas de Culex.Culex is the largest genus of the tribe Culicini with 767 described species and includes vectors of several arboviruses and filarial worms. Nevertheless, studies about their taxonomy and phylogeny are still scarce. The identification of mosquitoes is usually based on morphological characters. However, many species of Culex are morphologically similar, making difficult their correct identification. Currently, molecular techniques have been used in both evolution studies and the species distinction, including those belonging to complex. Thus, sequences of ITS2 of rDNA from 15 species belonging to the genus Culex and one of Lutzia were cloned and sequenced in order to examine the genomic divergences and verify the applicability of this marker in phylogenetic analysis in the study group. Three to seven clones per individual were sequenced, generating 144 sequences, ranging from 199 to 339 bp. The topology was obtained using the Neighbor-joining method with uncorrected p-distance. The distance matrix obtained revealed the presence of intragenomic and intraspecific variation. Of the 31 specimens cloned and sequenced only one of Culex (Culex) mollis showed ali their identical sequences (5 clones), while one specimen of Culex (Culex) coronator showed differences in nucleotide composition between all the clones (6 clones). Due to the intragenomic varialility we selected the copies to distance analysis using the similarity of secondary structures of ITS2. lt was possible to delete the copies that were more varied and less than 75% of similarity. Despite the heterogeneity observed within the sequences obtained from individuals of the same species are grouped and it was consistent with the current classification based on morphology. The NJ topology indicates the possible monophyly of subgenera Melanoconion and Microculex. However, this topology also indicates the paraphylism of the genus Culex related to Lutzia and subgenus Culex related to Phenacomyia. The position of Lutzia in the same group of Culex genus indicates that the generic status of this taxon is not supported by NJ analysis of ITS2 and, therefore, the correct would be Lutzia being considered a subgenus of Culex. The position of Phenacomyia in the group of Culex subgenus indicates this taxon can not be considered a Culex subgenus. Despite the heterogeneity, the ITS2 seems to be an appropriate marker to solve taxonomic questions of Culex