Virulência de propágulos de Metarhizium anisopliae e Metarhizium rileyi: investigação molecular durante a infecção a diferentes hospedeiros

Insect pathogens are a valuable tool to manage crop pests. They can be used in combination with insecticides to improve their performance and reduce the occurrence of resistance to commercially active ingredients The genus Metarhizium (Ascomycota: Hypocreales) is highly abundant, globally distributed, and best known for infecting and killing many different arthropods. Some Metarhizium species have a broad host range (generalists). In contrast, others show specificity for certain insect families (specialists) and can be used to test hypotheses regarding speciation and host specificity. In this work two Metarhizium species were investigated, M. anisopliae and M. rilyei, and their propagules produced in vitro: blastospores and aerial conidia. Many studies have shown that sequence data can provide crucial information about how these organisms reproduce and persist in different environments. Using Metarhizium spp. as a model, the first chapter briefly present the entomopathogenic fungi infection process and the benefits of using conidia and blastospores for biological pest control in the field. It also shows the main questions and hypotheses that build this work and introduce the advances achieved. The second chapter, a review article, highlights recent advances in genomics and molecular biology of entomopathogenic fungi to further investigate the gene-for-gene relationships in insect-fungus interactions. In the third chapter we investigated the biological and genetic factors that allow blastospores to infect insects and make them potentially effective for biological control in the field. While the generalist M. anisopliae produces under high osmolarity conditions smaller blastospores in more significant number, the Lepidopteran specialist M. rileyi produces fewer propagules with a higher cell volume. We also compared the virulence of blastospores and conidia of these two Metarhizium species towards the economically important caterpillar pest Spodoptera frugiperda. We found that conidia and blastospores from M. anisopliae were both infectious but killed fewer insects compared with M. rileyi conidia and blastospores, where M. rileyi conidia had the highest virulence. Using comparative transcriptomics during propagule penetration on insect cuticles, this third chapter also shows that M. rileyi blastospores expresses more virulence-related genes against S. frugiperda than M. anisopliae. In contrast, conidia of both fungi express more virulence-related oxidative stress factors than blastospores. These results highlight that blastospores use a different virulence mechanism than conidia, which may be explored in new biological control strategies. Finally, chapter four investigated the phenotypical plasticity of M. anisopliae blastospores among different insect species. We determined that M. anisopliae blastospores are highly virulent for Tenebrio molitor, and the percentage of appressorium formation in the membranous wings of this insect was three times higher than in the wings of the other insects. We showed a clear difference in the gene expression pattern in the blastospores of M. anisopliae during the infective process in Gryllus assimillis, Spodoptera frugiperda, Apis mellifera, and Tenebrio molitor. This implies that M. anisopliae transcriptome and virulence change remarkably according to the insect, with the most significant differences for G. assimillis. These differences are associated with the expression of enzymes such as proteases, cutinases, lipases, and peptidases which might be related to the degradation of specific compounds of each insect wing; hydrophobins and destruxins which are associated with virulence and secondary metabolites. The gene expression profiles of fungal propagules during penetration on different insect cuticles were characterized to increase our understanding of the fungal process of insect pathogenicity. The results obtained here can potentially help to find gene candidates whose manipulation can ultimately lead to discovering more effective biological control agents.Os entomopatógenos são uma ferramenta valiosa para o manejo de pragas em culturas agrícolas e podem ser usados em combinação com inseticidas para melhorar seu desempenho e reduzir a ocorrência de resistência a ingredientes ativos. O gênero Metarhizium (Ascomycota: Hypocreales) é abundante, distribuído globalmente e mais conhecido por infectar e matar diferentes artrópodes. Algumas espécies de Metarhizium possuem uma ampla gama de hospedeiros (generalistas), enquanto outras apresentam especificidade para certas famílias de insetos (especialistas). Essa abrangência na capacidade de causar doença a insetos pode ser utilizada para testar hipóteses sobre especiação e especificidade aos hospedeiros. Neste trabalho foram investigadas as espécies M. anisopliae e M. rilyei, e seus propágulos produzidos in vitro: blastosporos e conídios aéreos. Muitos estudos mostraram que as sequencias gênicas podem fornecer informações cruciais sobre como esses organismos se reproduzem e persistem em diferentes ambientes. Usando Metarhizium spp. como modelo, o primeiro capítulo da tese apresenta brevemente o processo de infecção por fungos entomopatogênicos e os benefícios do uso de conídios e blastosporos para o controle biológico de pragas no campo. Mostra também as principais questões e hipóteses que constroem este trabalho e apresentam os avanços alcançados. O segundo capítulo é uma revisão bibliográfica, destacando os avanços recentes em genômica e biologia molecular de fungos entomopatogênicos, especialmente nas interações inseto-fungo. O terceiro capítulo aborda os fatores biológicos e genéticos que permitem que os blastosporos infectem insetos e os tornem potencialmente eficazes para o controle biológico no campo. Enquanto a espécie generalista M. anisopliae em condições de alta osmolaridade produz um maior número de blastosporos com menor volume celular, M. rileyi, especialista em lepidópteros, produz uma menor quantidade de propágulos com maior volume celular. Também comparamos a virulência de blastosporos e conídios dessas duas espécies de Metarhizium para a praga Spodoptera frugiperda. Descobrimos que conídios e blastosporos de M. anisopliae são infectivos, mas matam menos insetos quando comparados a conídios e blastosporos de M. rileyi, sendo os conídios de M. rileyi mais virulentos. Usando transcriptômica comparativa durante a penetração de propágulos na cutícula de lagartas, no terceiro capítulo revelamos que os blastosporos de M. rileyi expressam mais genes relacionados à virulência contra S. frugiperda do que M. anisopliae. Em contraste, os conídios de ambos os fungos expressam mais fatores de estresse oxidativo do que os blastosporos. Esses resultados destacam que os blastosporos usam um mecanismo de virulência diferente dos conídios, o que pode ser explorado em novas estratégias de controle biológico. Por fim, no quarto capítulo investigamos a plasticidade fenotípica de blastosporos de M. anisopliae entre diferentes espécies de insetos. Determinamos que os blastosporos de M. anisopliae são altamente virulentos para Tenebrio molitor, e a porcentagem de formação de apressórios nas asas membranosas deste inseto foi três vezes maior do que nas asas dos outros insetos. Nós demonstramos uma clara diferença no padrão de expressão gênica durante o processo infectivo em Gryllus assimillis, Spodoptera frugiperda, Apis mellifera, e Tenebrio molitor. Isso significa que o transcriptoma e a virulência de M. anisopliae mudam consideravelmente de acordo com o inseto, com diferença significativa para G. assimillis. Tais diferenças estão associadas à expressão de enzimas como proteases, cutinases, lipases e peptidases, que podem estar relacionadas à degradação de compostos específicos da asa de cada inseto; hidrofobinas e destruxinas que estão associadas à virulência e metabolismo secundário. Os perfis de expressão gênica de propágulos fúngicos durante a penetração em diferentes asas de insetos foram caracterizados com o objetivo de aumentar nossa compreensão do processo fúngico de patogenicidade e virulência de M. anisopliae a insetos. Os resultados aqui obtidos podem potencialmente ajudar a encontrar genes candidatos cuja manipulação pode facilitar a descoberta de agentes de controle biológico mais eficazes