Initial characterization of Hox genes in a lower Diptera

Os genes Hox codificam fatores de transcrição que são altamente conservados em metazoários e são identificados pela presença de um domínio ligante de DNA denominado homeodomínio. Neste trabalho, foi realizada a caracterização inicial dos genes Hox no modelo não convencional Pseudolycoriella hygida e nos sciarídeos Bradysia tilicola e Bradysia cellarum, dípteros que pertencem à infraordem Bibionomorpha. Em insetos, os Hox especificam a identidade dos segmentos corporais e são expressos em colinearidade espacial. Os genes Hox foram inicialmente identificados e caracterizados no modelo Drosophila melanogaster. Neste organismo esses genes encontram-se organizados em dois complexos gênicos denominados complexo Antennapedia, que compreende os genes labial (lab), proboscipedia (pb), Hox3 (compreende zen2, zen e bicoid), Deformed (dfd), Sex combs reduced (Scr), fushi tarazu (ftz) e Antennapedia (Antp) e complexo Bithorax, que compreende os genes Ultrabithorax (Ubx), abdominal-A (abdA) e Abdominal-B (AbdB). Em D. melanogaster, o complexo Hox encontra-se localizado no cromossomo III e os dois complexos gênicos são separados por um segmento genômico de 9.7 Mb. Neste trabalho, os genes Hox de Psl. hygida foram anotados e os transcritos foram identificados. Modelos gênicos foram montados manualmente a partir de dados obtidos com o software EMBOSS e as estruturas gênicas foram propostas. Porções dos genes lab, Ubx, abdA e AbdB foram clonadas no vetor pGEM-T a partir do DNA genômico ou cDNA de embriões de Psl. hygida. Estes clones foram empregados como ponto de partida para síntese de sondas utilizadas em experimentos de hibridação in situ de RNAm em embriões. Experimentos de imunolocalização de proteínas foram realizados com a finalidade de caracterizar o padrão de expressão de Antp, Ubx/abdA e AbdB utilizando anticorpos comerciais contra as respectivas proteínas de D. melanogaster. Nossos resultados mostram que o complexo Hox de Psl. hygida e B. tilicola estão localizados no cromossomo X. Em Psl. hygida, o tamanho dos genes Hox varia de 109342 pb (Scr) a 266346 bp (pb) e isoformas de mRNA foram encontradas para todos os genes anotados. A análise das sequências polipeptídicas deduzidas demonstrou a presença do homeodomíneo em praticamente todas as isoformas anotadas. Os experimentos de imunolocalização demonstraram que Ubx e AbdA são expressos em pelo menos 7 segmentos, 2 da região torácica (T2 e T3) e pelo menos 5 da região caudal, enquanto que a expressão da proteína Antp é detectada nos 3 segmentos torácicos (T1 a T3) e nos demais segmentos abdominais. Não foi possível detectar a expressão de AbdB com o anticorpo empregado, o que pode ser explicado pela baixa conservação desta proteína entre Psl. hygida e D. melanogaster. Diferentemente do que foi observado em outros Dípteros, nosso estudo sugere que em Sciarideos o complexo Hox encontra-se localizado no cromossomo sexual (X). A organização dos genes Hox em Psl. hygida revelou que os genes lab, pb e Dfd sofreram uma translocação e uma inversão. Este rearranjo aparentemente não afetou o padrão de expressão dos genes Hox ao longo do eixo anteroposterior indicando conservação da colinearidade espacial na região investigada do locus Hox de Psl. hygida. Em conjunto, os dados obtidos são relevantes e consistem na primeira investigação acerca do complexo Hox em sciarídeos.The Hox genes encode highly conserved metazoan transcription factors which are identified by the presence of a DNA-binding domain named the homeodomain. In this study, we present the initial characterization of the Hox genes in the unconventional model organism, Pseudolycoriella hygida, and also in the sciarids Bradysia tilicola and Bradysia cellarum, all dipterans that belong to the Biobionomorpha infraorder. In insects, the Hox genes specify the identity of body segments and are expressed according to spatial collinearity. The Hox genes were initially identified and characterized in the model organism Drosophila melanogaster. In this organism the Hox genes are organized into two gene complexes named the Antennapedia complex, which comprises labial (lab), proboscipedia (pb), Hox3 (comprises zen2, zen and bicoid), Deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr), fushi tarazu (ftz) and Antennapedia (Antp) and the Bithorax complex which comprises the Ultrabithorax (Ubx), abdominal- A (abdA) and Abdominal-B (AbdB) genes. In D. melanogaster, the Hox complex is located on chromosomes III and the two gene complexes are separated by a 9.7 Mb genomic segment. In this work, the Psl. hygida Hox genes were annotated and the transcripts identified. Gene models were manually assembled using the results obtained using the EMBOSS software and gene structures were proposed. Partial sequences of the lab, Ubx, abdA and AbdB genes were cloned into the pGEM-T vector using as a starting point genomic DNA or cDNA from Psl. hygida embryos. These clones were employed as templates for the synthesis of probes that were used in situ hybridization experiments. Protein immunolocalization experiments were perfomed in order to characterize the pattern of expression of Antp, Ubx/abdA and AbdB using commercial antibodies against D. melanogaster proteins. Our results reveal that the Psl. hygida and B. tilicola Hox complexes are located on the X chromosome. In Psl. hygida, the size of the Hox genes ranged from 109342 bp (Scr) to 266346 bp (pb) and isoforms were found for all annotated genes. The analysis of the deduced polypeptide sequences revealed the presence of the homeodomain in almost all annotated isoforms. The immunolocalization experiments showed that Ubx and AbdA are expressed in at least 7 segments, 2 in the thoracic region (T2 and T3) and at least 5 in the caudal region, while the expression of the Antp protein is detected in the 3 thoracic segments (T1 to T3) and all abdominal segments. It was not possible to detect AbdB expression with the antibody that we used, which can be explained by the low conservation of this protein between Psl. hygida and D. melanogaster. Unlike what has been observed in other Diptera, our study suggests that in sciarids the Hox complex is located in the sexual chromosome (X). The organization of Hox genes in Psl. hygida indicates that the lab, pb and Dfd genes underwent a translocation and inversion. This rearrengment apparently did not impact on the pattern of expression of Hox genes along the anteroposterior axis, indicating that the spatial collinearity is conserved in the region investigated in the Hox locus of Psl. hygida. Taken together, the results of this work are relevant and constitute the first investigation carried out on the Hox complex in sciarids