Characterization of PIMREG as a biomarker in gliomas

Os tumores do sistema nervoso central (SNC) se originam a partir da proliferação descontrolada de células da glia, apresentando diferentes perfis patológicos, histológicos e moleculares, os quais determinam as características clínica da doença e a resposta terapêutica. Os gliomas representam cerca de 40% a 60% de todos os tumores primários do (SNC), sendo mais comum em adultos. Baseado na classificação histológica e grau de malignidade os tumores podem ser classificados em: astrocitoma (grau 2-4), oligodendroglioma (grau 2-3) e glioblastoma (GBM) (grau 4). GBM é o subtipo mais agressivo entre gliomas, sendo uma doença heterogênea e que apresenta um tempo médio de sobrevida de 12 a 15 meses após o diagnóstico. A recorrência da doença é bastante comum para esse tipo de tumor e não existe um tratamento terapêutico alvo-específico. Desta forma, existe uma necessidade inerente de buscar novos biomarcadores moleculares para definir melhor as categoriais de diagnóstico, prognóstico e prevenção de resposta terapêutica. PIMREG é um marcador de proliferação que desempenha papel no controle do ciclo celular e tumorigênese. Pesquisadores relataram níveis elevados de PIMREG em amostras tumorais em relação ao tecido normal de pacientes com diversos tipos de câncer. Dados recentes do nosso grupo mostraram que as amostras de pacientes com glioma apresentam níveis elevados do transcrito de PIMREG e que estão relacionados positivamente com o grau de malignidade, sendo que o subtipo GBM apresenta maior expressão. Assim, nós hipotetizamos que PIMREG poderia ser um potencial biomarcador para esse tipo de tumor. O objetivo do presente trabalho foi analisar a expressão proteica de PIMREG em amostras fixadas e embebidas em de pacientes com diferentes subtipos e graus de gliomas difusos. O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética sob o n° parecer: 4.137.485, com emenda n°5.301.366. Foram utilizados 87 casos retrospectivos de amostras tumorais de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP). Treze Tissue Microarray (TMAs) foram produzidos, cada qual com 24 cilindros, sendo um deles com controle negativo e os demais com amostras tumorais (3 regiões representativas por amostra, escolhidas pelos patologistas). Após, na técnica de imuno-histoquímica (IHQ) a recuperação antigênica foi realizada em panela à vapor com tampão TRIS-EDTA pH 9,0 para PIMREG e com tampão citrato pH 6,0 para Ki-67 (biomarcador utilizado na prática clínica). As incubações dos anticorpos primários anti-FAM64A (Sigma-Aldrich - HPA049934) na concentração 1:50 e do anticorpo anti-Ki-67(Abcam® - ab16667) na concentração 1:150 foram overnight. Para detecção do anticorpo primário PIMREG e Ki-67 foi utilizado o sistema de detecção HRP/DAB IHC Detection Kit-Micro-polymer. As lâminas imunomarcadas foram digitalizadas utilizando o sistema de escaneamento de lâminas Scan Scope VS120 e microscópio BX61 (Olympus). A expressão de PIMREG e Ki-67 foi quantificada através do número de núcleos com marcação positiva, pelo número total de núcleos, expresso em porcentagem (multiplicado por 100), avaliado com o software ImageJ (Fiji). As análises mostraram que há maior expressão de PIMREG na região tumoral quando comparada com a região não tumoral. Entre os graus histológicos de malignidade do tumor, a expressão de PIMREG é mais elevada no grau 4. O grau de associação entre PIMREG e Ki-67 foi Sperman r = 0.6592, sugerindo que existe correlação entre as duas variáveis. Houve significância da influência da expressão log de PIMREG na sobrevida dos pacientes através da regressão de Cox com as variáveis: idade, óbito e grau de malignidade. Através da curva ROC foram obtidos dois pontos de corte (1,16 e 2,04) para imunoexpressão de PIMREG para avaliar a taxa de sobrevida nos dois grupos observando que os grupos com expressão acima dos pontos de corte a mediana de sobrevida foi de 14-16 meses. Além disso, a expressão gênica de PIMREG foi avaliada em 1106 amostras de glioma do coorte do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA). Os níveis do transcrito de PIMREG se mostraram mais elevados no grupo que não possui metilação na região promotora do gene MGMT, nos grupos que apresentam homodeleção de CDKN2A/CDKN2B e no grupo que apresenta os genes de IDH selvagens. Coletivamente, nossos dados mostram a relação da expressão gênica e proteica de PIMREG com o subtipo mais agressivo do tumor e sugere que esta proteína tem potencial para ser utilizada como um biomarcador para indicar progressão da doença.Central nervous system (CNS) tumors originate from the uncontrolled proliferation of glia cells, presenting different pathological, histological, and molecular profiles, which determine the clinical characteristics of the disease and the therapeutic response. Gliomas represent about 40% to 60% of all primary tumors of the (CNS), being more common in adults. Based on histological classification and the degree of malignancy tumors can be classified in astrocytoma (grade 2-4), oligodendroglioma (grade 2-3) and glioblastoma (GBM) (grade 4). GBM is the most aggressive subtype among gliomas, being an heterogeneous disease with an overall survival of 12-15 months after diagnosis. The recurrence of the disease often occurs for this type of tumor and no target-directed therapy are available. Thus, there is a need for novel molecular biomarkers for better classification and to predict prognosis and therapeutic response. PIMREG is a proliferation marker that plays a role in cell cycle control and tumorigenesis. Researchers reported high levels of PIMREG in tumor samples of patients with different types of cancer. Recent data from our group showed that samples of glioma patients have high levels of PIMREG transcript and that they are positively related to the degree of malignancy, being GBM subtype with the highest expression. Thus, we hypothesized that PIMREG could be a potential biomarker for this type of tumor. The objective of the present work was to analyze the protein expression of PIMREG in histological cuts of tumor samples of patients with different subtypes and malignant grades of diffuse gliomas. The work was approved by the local Ethics Committee under the registration number 4.137.485, with amendment n°. 5.301.366. Eighty-seven retrospective cases of patient tumor samples from the Hospital das Clínicas of the Ribeirão Preto Medical School (HCFMRP) were used. Thirteen Tissue Microarray (TMAs) were produced. Each TMA contained 24 cylinders, one of negative control and 23 tumor samples (3 representative regions per sample, chosen by pathologists). For the immunohistochemistry (IHC), antigenic recovery was performed with Tris-EDTA pH 9.0 for PIMREG and with pH 6.0 citrate buffer for KI-67 (biomarker used in clinical practice). Samples were incubated with anti-FAM64A (SIGMA-ALDRICH-HPA049934; 1:50) and anti-Ki-67 (ABCAM®-AB1667; 1:150) primary antibodies overnight. For detection of the primary antibody, the HRP/DAB IHC detection system was used. The immunostained slides were scanned using the Scan Scope VS120 scanning system and BX61 microscope (Olympus). The expression of PIMREG and Ki-67 was quantified by the number of positive stained nuclei, by the total number of nuclei, expressed in a percentage (multiplied 100), using the IMAGEJ software (Fiji). The analyzes revealed that PIMREG is highly expressed in the tumor region compared to the non-tumor region. Also, PIMREG expression is higher in grade 4 of malignancy. The degree of Sperman association between PIMREG and Ki-67 was r= 0.6592, suggesting that there is correlation between the expression of both proteins. There was a significance of PIMREG log expression on patient survival through Cox regression with: age, death, and degree of malignancy. Through the ROC curve, two cutoff points (1.16 and 2.04) were obtained for IMPREG immunoexpression to assess the survival rate in both groups, noting that the groups with expression above the cutoff points the median survival was 14 -16 months. In addition, we evaluated PIMREG\'s gene expression in 1106 patient samples of The Cancer Genome Atlas (TCGA) data base. PIMREG gene expression was higher in the group without MGMT promoter methylation, in the groups with CDKN2A/CDKN2B homodelation, and the group harboring the wild type IDH genes. Collectively, our data show the relationship of PIMREG gene and protein expression with the most aggressive subtype of glioma and suggests that this protein has the potential to be used as a biomarker to indicate disease progression