Signalling pathways triggered by the activation of Heterocephalus glaber TrkA with nerve growth factor

A nocicepção é caracterizada pela sensação de dor aguda captada por neurônios periféricos (nociceptores) perante um estímulo nocivo (térmico ou mecânico). Nociceptores são neurônios capazes de sensibilizar a dor em indivíduos através de cascatas de sinalização desencadeadas por diversos fatores, incluindo-se o fator de crescimento neural (NGF - nerve growth factor) frente um contexto de injúria ou inflamação. O NGF é um fator neurotrófico que auxilia na manutenção de neurônios, ligando-se ao seu receptor de alta afinidade, tropomyosin-related kinase A (TrkA), um receptor acoplado a uma tirosina quinase. Essa interação ativa vias de sinalização relacionadas à sobrevivência e prevenção da apoptose, concomitantemente à sensibilização de vias de dor através da ativação de um canal de cátions (transient receptor potential vaniloid 1 - TRPV1), relacionado à percepção de dor causada por calor ou por capsaicina (composto ativo de pimentas). Finalmente, ocorre a sensibilização dos nociceptores a partir de um potencial de ação gerado pela ativação de TRPV1, que permite o influxo de cátions e despolariza o nociceptor. O rato toupeira pelado - naked mole rat (NMR) é um roedor africano que possui características fisiológicas a serem estudadas que o levam a condições intrigantes, como extrema longevidade, resistência a câncer e insensibilidade à dor. Estudos recentes indicam uma menor atividade da TrkA de NMR. Essa baixa eficiência afeta diretamente a via da dor, à medida que a fosforilação de proteínas da via da TrkA fica comprometida pela baixa taxa de ativação pela auto-fosforilação do receptor e disposição reduzida de sítios de ancoragem de proteínas substratos (que surgem devido a essa ativação). É fundamental compreender que mutações presentes na TrkA do NMR afetaria as diferentes vias de sinalização da dor que contribuiriam para a insensibilidade à dor desse organismo. No total apenas quatro resíduos presentes no domínio quinase da TrkA de NMR são diferentes da TrkA de rato ou humana sendo que dois desses resíduos estão presentes apenas na TrkA do NMR. No presente trabalho, através de mutagênese sítio dirigida substituindo resíduos da TrkA de rato por resíduos da TrkA do NMR e avaliando a ativação das principais vias de sinalização ativadas pela TrkA, pudemos simular o efeito dos resíduos de aminoácidos presentes no NMR inseridos na TrkA de rato (totalmente funcional). Analisando a fosforilação de diferentes tirosinas auto-fosforiladas pela TrkA pudemos concluir que as mutações analisadas isoladamente (Leu775Cys e Lys728Gln) não tiveram a sua fosforilação diminuída de forma significante o que nos levou a analisar a ativação de uma das proteínas alvo da TrkA - PLCy, que teve a sua fosforilação diminuída. Essa investigação poderá servir de base para avaliar as vias essenciais mediadas pela TrkA que levam à dor auxiliando a identificação de novos alvos e o desenvolvimento de drug leads num contexto de busca para novos terapêuticos que substituam fármacos analgésicos não opioides.Nociception is characterized by the sensation of acute pain captured by peripheral neurons (nociceptors) upon a noxious stimulus (thermal or mechanical). Nociceptors are neurons capable of sensitizing pain in individuals through signaling cascades unleashed by several factors, including the nerve growth factor (NGF) in a context of injury or inflammation. NGF is a neurotrophic factor that helps in neurons maintenance, binding to its high-affinity receptor, tropomyosin-related kinase A (TrkA), a tyrosine kinase coupled receptor. Such interaction activates signaling pathways related to survival and prevention of apoptosis, simultaneously to pain-related pathways through the activation of a cation ion channel (transient receptor potential vanilloid 1 TRPV1), related to pain perception caused by heat or capsaicin (active compound of peppers). Finally, the sensitization of nociceptors occurs after an action potential generated by the activation of TRPV1, which allows cations influx, depolarizing the nociceptor. The naked mole rat (NMR) is an African rodent whose physiological characteristics still under investigation leads to intriguing conditions, such as extreme longevity, cancer resistance and pain insensitivity. Recent studies indicate that NMR TrkA is hipoactive. This low efficiency directly affects the pain pathway, considering the disruption in the activation of downstream proteins by the low phosphorylation rate for auto-activation of the receptor and reduced disposition of anchoring sites of substrates (which arise due to this activation and autophosphorylation). It is of great importance to understand which mutations in the NMRs TrkA would affect different signaling pain pathways that would contribute to pain insensitivity of this organism. In total, in the kinase domain only four residues of NMR TrkA kinase domain are different from rats or humans, of which two are exclusive of NMR. In the present study, using site-directed mutagenesis exchanging rat TrkA residues for NMR residues, and evaluating the activation of the main signaling pathways activated by TrkA, we could simulate the effect of the amino acid residues present on NMR inserted in rat TrkA (fully functional). Analyzing the phosphorylation of different tyrosines auto-phosphorylated by TrkA we could conclude that the analyzed point mutations isolated (Leu775Cys and Lys728Gln) did not lead to a significantly diminished phosphorylation. This led us to analyze the activation of one of the TrkAs target proteins (phospholipase gamma - PLCy), which showed a reduced phosphorylation. This investigation could be useful to evaluate essential pathways mediated by TrkA that leads to pain aiding the identification of new targets and the development of drug leads on a context of searching for new therapeutic targets that replace non-opioid analgesics