Glutaminolysis dynamics in astrocytomas and GLSiso2 (GAC) gene silencing: mechanism of action

O glioblastoma (GBM) é o tumor maligno de alto grau mais frequente no do sistema nervoso central e com pior prognóstico, mesmo com uso da terapia combinada envolvendo ressecção cirúrgica máxima, radioterapia e quimioterapia com temozolomida (TMZ). As células tumorais têm capacidade de reprogramar sua maquinaria metabólica para atender às suas necessidades biosintéticas e bioenergéticas, por meio de uma variedade de vias alternativas de produção de energia, dependendo da disponibilidade de nutrientes. A glutaminólise, o processo pelo qual a glutamina é transportada para dentro da célula e é convertida em -cetoglutarato para entrar no ciclo do ácido tricarboxílico, é regulada positivamente em vários tipos de câncer, incluindo GBM. A glutaminase (GLS) é o principal regulador desta via e apresenta duas formas em humanos: GLS tipo rim (KGA ou GAC) e GLS2 tipo fígado (LGA ou GAB), com distribuição, regulação e funções distintas. O gene GLS apresenta duas isoformas: GLSiso1 e GLSiso2 e sua regulação em células tumorais ainda não é bem compreendida. No presente estudo, analisamos os níveis de expressão gênica relacionada à glutaminólise em nossa coorte de 153 astrocitomas de diferentes graus de malignidade e 22 amostras cerebrais não neoplásicas por meio de qRT-PCR. Adicionalmente, investigamos o perfil de expressão proteica dos principais reguladores da glutaminólise: GLS, glutamato desidrogenase (GLUD1), glutamato piruvato transaminase (GPT2); e reguladores da biossíntese de glutationa (GSH): GSH sintase (GS) e níveis de GSH em diferentes graus de astrocitoma estratificados pelo estado mutacional de IDH1. As expressões gênicas diferenciais foram validadas in silico no banco de dados TCGA GBM-RNASeq. Em GBM, o acúmulo de Glu devido ao aumento da expressão de GPT2 e GLUD1 correlacionou-se com o aumento da expressão de genes relacionados à síntese de GSH que poderiam favorecer a sobrevivência de células tumorais, principalmente no subtipo de GBM mesenquimal mais agressivo. Em contraste, a análise de correlação in silício do conjunto de dados TCGA mostrou que GLUD1 pode levar à diminuição da síntese de GSH em astrocitoma de baixo grau IDH1mut, aumentando a suscetibilidade ao estresse oxidativo, tornando-os mais sensíveis à radioterapia e à terapia alquilante. Sendo assim, a monitoração dos níveis de expressão de GLUD1 e GPT2 medindo enzimas e produtos de seus metabolitos, como amônia e alanina, utilizando técnica de imagem não invasiva, poderia potencialmente detectar a progressão de astrocitoma de baixo grau com mutação IDH1 para GBM secundário. Além disso, o aumento gradual da expressão de ambas as isoformas GLS, GLSiso1 e GLSiso2, foi observado em paralelo ao aumento da malignidade do astrocitoma. É importante ressaltar que a expressão de GLSiso2 no tecido cerebral normal foi menor do que GLSiso1, apontando GLSiso2 como alvo terapêutico interessante. O papel de GLSiso2 na tumorigênese foi analisado através do silenciamento gênico da isoforma utilizando a técnica de siRNA em células U87MG-GBM. O silenciamento de GLSiso2 levou à diminuição da proliferação celular, parada do ciclo na fase G1 e aumento da resposta das células tumorais para o tratamento com TMZ. Os dados do transcriptoma de RNAseq e ensaios funcionais mostraram a associação de GLSiso2 com um shift metabólico em direção ao efeito Warburg, interferindo principalmente no nível de lactato no microambiente tumoral. Além disso, uma diminuição de 48,6% do processo angiogênico foi observada pelo ensaio de sprouting utilizando esferoides provenientes da linhagem endotelial HUVEC que foram expostos ao meio condicionado de células U87MG silenciadas com GLSiso2. Tal diminuição angiogênica foi provavelmente mediada por VEGF-A, TNF- e ANGPTL2 cujos níveis foram reduzidos no meio condicionado de células GLSiso2 silenciadas em relação ao NTC. Esses achados de ensaios funcionais in vitro corroboraram com a hipótese de que o GLSiso2 e um potencial novo alvo terapêutico para pacientes com GBM|Glioblastoma (GBM) is the most frequent and high-grade adult malignant central nervous system tumor, with poor prognosis despite the combined therapy involving maximal surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy with temozolomide (TMZ). Tumor cells can reprogram their metabolic machinery to meet their biosynthetic and bioenergetic needs, through a variety of alternative energy production pathways depending on the availability of nutrients. Glutaminolysis, the process by which the glutamine is transported into cell and converted into -ketoglutarate to enter into the tricarboxylic acid cycle, is upregulated in several cancer types, including GBM. Glutaminase (GLS) is the main regulator of this pathway and presents two forms in humans: kidney-type GLS (KGA or GAC) and liver-type GLS2 (LGA or GAB), with distinct tissue distribution, regulation and functions. The GLS gene presents two isoforms: GLSiso1 and GLSiso2 and their regulation in tumor cells is still not well understood. In the present study, we analyzed the glutaminolysis-related gene expression levels in our cohort of 153 astrocytomas of different malignant grades and 22 non-neoplastic brain samples through qRT-PCR. Additionally, we investigated the protein expression profile of the key regulator of glutaminolysis: GLS, glutamate dehydrogenase (GLUD1), glutamate pyruvate transaminase (GPT2); and regulators of glutathione (GSH) biosynthesis: GSH synthase (GS) and GSH levels in different grades of astrocytoma stratified by the IDH1 mutational status. The differential gene expressions were validated in silico on the TCGA GBM-RNASeq database. Particularly in GBM, the accumulation of Glu due to GPT2 and GLUD1 downregulation correlated to upregulation of genes related to GSH synthesis which could favor tumor cell survival, mostly in the most aggressive mesenchymal GBM subtype. In contrast, in silico TCGA dataset correlation analysis showed that GLUD1 may lead to decrease in GSH synthesis in IDH1mut low-grade astrocytoma increasing the susceptibility to oxidative stress, rendering them more sensitive to radiation therapy and to alkylating therapy. Thus, monitoring GLUD1 and GPT2 expression levels by measuring their end metabolites enzymes such as ammonia, and alanine by a non-invasive imaging technique may potentially detect the progression of lower-grade astrocytoma harboring IDH1mutation towards secondary GBM. Additionally, gradual expression increase of both GLS isoforms, GLSiso1 and GLSiso2, was observed in parallel to the increase of astrocytoma malignancy. Importantly, GLSiso2 expression in normal brain tissue was lower than GLSiso1, which pointed GLSiso2 more eligible as therapeutic target. GLSiso2 role in tumorigenesis was analyzed by silencing this isoform through siRNA in U87MG-GBM cells. GLSiso2 silencing led to decrease of tumor cell proliferation, cycle arrest at G1 phase and increase of tumor cell response for TMZ. The RNAseq transcriptome data and functional assays showed the association of GLSiso2 with metabolic shift towards Warburg effect, mainly interfering with lactate level in tumor microenvironment. Moreover, a decrease of 48.6% of angiogenic process was observed by sprouting assay of HUVEC spheroids exposed to GLSiso2 silenced U87MG cells conditioned media. Such angiogenic decrease was problably mediated by VEGF-A, TNF- and ANGPTL2 which levels were reduced in the conditioned media of GLSiso2 silenced cells compared to NTC. These findings of in vitro functional assays corroborated GLSiso2 as a potential new therapeutic target for GBM patient