Evaluation of the synergistic effect of LPMO AfAA9_B from Aspergillus fumigatus in the hydrolysis of lignocellulosic material

Desde o advento da revolução industrial o consumo de energia global aumentou exponencialmente, tendo como principal matriz os combustíveis fósseis. Como consequência, atualmente o mundo enfrenta não somente escassez de energia como também problemas com a poluição gerada com a queima desses materiais. Nesse cenário, materiais como a biomassa lignocelulósica, até então vistos como resíduos, ganham destaque. Esses materiais formados por 3 componentes principais (32-55% celulose; 19-32% hemicelulose; e 19-32% lignina), devido aos seus polissacarídeos constituintes são ricos em energia e se apresentam como uma possível alternativa sustentável para a geração de energia e produção de combustíveis, como por exemplo, o etanol de segunda geração (2G) obtido a partir do bagaço de cana-de-açúcar. Contudo, tais materiais são altamente recalcitrantes e necessitam de tratamentos prévios para que os polissacarídeos se tornem disponíveis e sejam quebrados em unidades de açúcares simples para posterior fermentação. Nesse sentido, as Glicosil Hidrolases (GHs) juntamente com as Monooxigenases Líticas de Polissacarídeos (LPMOs) destacam-se como uma das principais enzimas atuantes na quebra dos mesmos. As LPMOs são enzimas da classe AA (Atividade Auxiliar) com mecanismos de ação oxidorredutivos que atuam nos carbonos C1 e/ou C4 das ligações glicosídicas de açúcares complexos como a celulose e quitina e que podem intensificar a ação de outras celulases canônicas. A fim de contribuir com o estudo de novas enzimas, nesse trabalho caracterizamos o novo gene AFUA_4G07850 codificante da AfAA9_B, uma LPMO de Aspergillus fumigatus secretada quando crescido na presença de bagaço de cana explodido (SEB). O alinhamento da sequência com as demais LPMOs descritas na literatura, permitiu a identificação dos resíduos His1, His86 e Tyr175 conservados como constituintes da braçadeira de histidina, estrutura catalítica característica desse tipo de enzima. Análises das estruturas secundárias e terciárias realizadas via dicroísmo circular (CD) e emissão de fluorescência intrínseca de triptofano (ITFE), respectivamente, demonstraram a presença de 8,3% de alfa hélices, 31,4% de folhas beta, 11,9% de alças e 48,4% de estruturas desordenadas e que seus resíduos de Trp tornam-se mais expostos ao meio aquoso com o aumento da temperatura. Além disso, o valor da temperatura de transição da enzima (Tm) do estado nativo para o desnaturado foi de 55,22 °C via CD e 53,60 °C via ITFE. A caracterização da atividade da enzima demonstrou que a enzima atua melhor em pH=9, sendo capaz de manter 100% de sua atividade mesmo após incubações de 24 a 72 horas na faixa de pH de 3 a 10. A enzima também é capaz de manter aproximadamente 70% de sua atividade após 72 horas a 50°C e mais de 50% após 48 horas a 60°C. As constantes cinéticas (usando 2,6-DMP como substrato) apresentaram valores de KM = 0,79 µM e Vmax = 1481 U/g quando em pH=9. A AfAA9_B é tolerante a Tween 20, SDS, SLS e Triton X-100, e a produtos de hidrólise como glicose e celobiose, apresentando mais de 80% da atividade residual. Por fim, em ensaios de atividade sob CMC na presença de outras GHs de A. fumigatus (também induzidas pela presença de SEB no meio de cultivo), foi constatado que a AfAA9_B não atua em sinergia com a celobiohidrolase AfCel6A, porém na presença de coquetel Celluclast® 1,5L e da endoglucanase Af-EGL7, a adição de LPMO foi responsável por aumentos de 3,5 e 8X na liberação de açúcares, respectivamente. Em ensaios de hidrólise com SEB e sabugo de milho, a suplementação da AfAA9_B resultou em aumento na degradação de 2X na presença de coquetel, e de 1,5X na presença da Af-EGL7, respectivamente. Tais resultados reforçam o potencial da AfAA9_B como enzima passível de ser adicionada em coquetéis comerciais e empregada em biorrefinarias com foco na produção de etanol 2G.Since the advent of the industrial revolution, global energy consumption has increased exponentially, with fossil fuels as the main source. As a result, the world currently faces not only energy shortage but also problems with the pollution generated by the burning of these materials. In this scenario, materials such as lignocellulosic biomass hitherto seen as waste gain prominence. These materials formed by 3 main components (32-55% cellulose; 19-32% hemicellulose; and 19-32% lignin), due to their constituent polysaccharides, are rich in energy and present themselves as a possible sustainable alternative for energy generation and production of fuels such as second generation ethanol (2G) obtained from sugarcane bagasse. However, such materials are highly recalcitrant and require previous treatments for the polysaccharides to become available and to be broken down into simple sugar units for further fermentation. In this sense, the Glycosyl Hydrolases (GHs) together with the Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) stand out as the main enzymes acting in their breakdown. LPMOs are class AA enzymes (Auxiliary Activity) with oxidoreductive mechanisms of action that act on the C1 and/or C4 carbons of the glycosidic bonds of complex sugars such as cellulose and chitin and that can intensify the action of other canonical cellulases. In order to contribute to the study of new enzymes, in this work we characterized the new gene AFUA_4G07850 encoding AfAA9_B, an LPMO of Aspergillus fumigatus secreted when in presence of sugarcane exploded bagasse (SEB). Alignment of the sequence with other LPMOs described in the literature allowed the identification of conserved His1, His86 and Tyr175 residues as constituents of the histidine bracer, a catalytic structure characteristic of this type of enzyme. Analyzes of secondary and tertiary structures performed via circular dichroism (CD) and intrinsic tryptophan fluorescence emission (ITFE), respectively, showed the presence of 8.3% of alpha helices, 31.4% of beta sheets, 11.9% of loops and 48.4% of disordered structures and that their Trp residues become more exposed to the aqueous medium as the temperature increases. Furthermore, the value of the enzyme transition temperature (Tm) from the native to the denatured state was 55.22 °C via CD and 53.60 °C via ITFE. The characterization of the enzyme activity showed the LPMO works better at pH=9, being able to maintain 100% of its activity even after incubations of 24 to 72 hours in the pH range from 3 to 10. The enzyme is also able to maintain approximately 70% of its activity after 72 hours at 50°C and more than 50% after 48 hours at 60°C. The kinetic constants (using 2,6-DMP as substrate) showed values of KM = 0.79 µM and Vmax = 1481 U/g under pH=9. Another aspect observed was the high tolerance of the enzyme (>80% residual activity) in the presence of detergents such as Tween 20, SDS, SLS and Triton X-100, as well as hydrolysis products such as glucose and cellobiose. Finally, on CMC activity assays in the presence of other A. fumigatus GHs (also induced by SEB presence in the medium), it was found that AfAA9_B does not act synergistically with cellobiohydrolase AfCel6A, while in the presence of Celluclast® 1.5L cocktail and Af-EGL7 endoglucanase, the addition of LPMO was responsible for increases of 3.5 and 8X in the sugar releasing, respectively. In hydrolysis assays with SEB and corn cob, AfAA9_B supplementation resulted in a degradation increase of 2X in the presence of cocktail, and 1.5X in the presence of Af-EGL7, respectively. These results reinforce the potential of AfAA9_B as an enzyme that can be added to commercial cocktails and employed in biorefineries focused on the production of 2G ethanol