Estudo das interações entre Pseudomonas aeruginosa e Burkholderia contaminans em infeções associadas a biofilmes em ambiente de fibrose cística

Dissertação de mestrado em BiotechnologyThe Gram-negative Pseudomonas aeruginosa and the Burkholderia cepacia complex are opportunistic pathogenic bacteria commonly responsible for severe infections in Cystic Fibrosis (CF) patients. These bacteria form biofilms in the airways, making infections challenging to treat. Recently, some advances have been made to understand the complex interaction between microorganisms and their implications for disease prognosis and therapy response in CF. Therefore, this study aimed to contribute to the knowledge of the potential role of interactions between P. aeruginosa and the emerging B. contaminans during infection, as well as their impact on the action of antibiotics frequently used to control P. aeruginosa. Regarding their biofilm formation ability, the presence of B. contaminans resulted in a decrease in biomass and the number of cultivable cells in dual-species biofilms compared to P. aeruginosa single biofilms after 72h, suggesting an antagonistic interaction between the bacteria. Concerning the role of these microbial interactions in susceptibility to colistin and ciprofloxacin, the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) was first determined. For ciprofloxacin, it was determined to be 0.25mg/L for both, while for colistin, the MIC varied between 0.5 and 1mg/L for P. aeruginosa, and it was not possible to determine the MIC of this antibiotic in B. contaminans. In biofilms, P. aeruginosa exhibited higher susceptibility to ciprofloxacin treatment, in the presence of B. contaminans, at concentrations starting at 2 × MIC. Several genes associated with virulence in P. aeruginosa were analyzed, and the specificity of the primer pairs corresponding to the genes pqsE, lasI, and mucA in P. aeruginosa were confirmed by PCR and qPCR. Additionally, RNA extraction was optimized for B. contaminans biofilms, concluding that using 10 biofilms yielded a greater RNA quantity. However, qPCR results indicated that 16S rRNA, the gene chosen for relative expression normalization, was not a suitable reference gene due to significant variation in cycle quantification across different conditions. Thus, further optimizations will be necessary to quantify the expression of the genes of interest. In summary, this study demonstrates how interspecies interactions can influence antibiotic susceptibility, enhancing our understanding of P. aeruginosa and B. contaminans behavior in dual-species biofilms.As Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa e do complexo Burkholderia cepacia são bactérias patogénicas oportunistas responsáveis por infeções graves em pacientes com Fibrose Cística (FC). Estas bactérias formam biofilmes nas vias aéreas, tornando as infeções difíceis de tratar. Recentemente, foram feitos alguns avanços para compreender a complexa interação entre diferentes microrganismos e as suas implicações no prognóstico da doença e na resposta à terapia em FC. Assim, este estudo teve como objetivo contribuir para o conhecimento do possível papel das interações entre P. aeruginosa e a emergente B. contaminans durante a infeção bem como o seu impacto na ação de antibióticos frequentemente utilizados no controlo de P. aeruginosa. No que refere a capacidade de formação de biofilme, a presença de B. contaminans resultou numa diminuição da biomassa e no número de células cultiváveis em biofilmes duplos em comparação com os biofilmes simples de P. aeruginosa após 72h, sugerindo uma interação antagonista entre as bactérias. No que diz respeito ao papel destas interações microbianas na suscetibilidade à colistina e ciprofloxacina, primeiro foi determinada a concentração Inibitória Mínima (CIM). No caso da ciprofloxacina foi determinada como sendo 0,25mg/L para ambas, enquanto a CIM para a colistina variou entre 0,5 e 1mg/L para P. aeruginosa, não sendo possível determinar o MIC deste antibiótico em B. contaminans. Em biofilmes, P. aeruginosa mostrou maior suscetibilidade ao tratamento com ciprofloxacina na presença de B. contaminans a concentrações a partir de 2× CIM. Para avaliar a expressão de alguns genes relacionados com a virulência em P. aeruginosa, a especificidade dos primers correspondentes aos genes pqsE, lasI e mucA foram confirmados por PCR e qPCR. Adicionalmente, a extração de RNA foi otimizada para biofilmes de B. contaminans, concluindo-se que a utilização de 10 biofilmes proporcionava uma maior quantidade de RNA. No entanto, os resultados da qPCR indicaram que o 16S rRNA, gene escolhido para a normalização da expressão relativa, não era um gene de referência adequado devido a variações significativas nos ciclos de quantificação detetados nas diferentes condiçõessob estudo. Assim, mais otimizações serão necessárias para quantificar a expressão dos genes de interesse. Em resumo, este estudo demonstra como as interações entre espécies podem influenciar a suscetibilidade aos antibióticos, melhorando a nossa compreensão do comportamento de P. aeruginosa e B. contaminans em biofilmes de espécies duplas