Development of a new vector for controlled gene expression in Acinetobacter baumannii

Dissertação de mestrado em BiotchenologyA Acinetobacter baumannii é um bacilo aeróbio gram-negativo que demonstra um rápido desenvolvimento de resistência aos agentes antimicrobianos, levando ao aparecimento de muitas estirpes multirresistentes a antibióticos (MDR). Devido à resistência generalizada desta bactéria a todas as classes de antibióticos, a Organização Mundial da Saúde (OMS) classificou a A. baumannii como prioridade crítica para a pesquisa de novos antibióticos, incentivando a comunidade científica a procurar novas alternativas. Os bacteriófagos são uma alternativa para combater infeções causadas por organismos MDR. Cada fago pode codificar um arsenal de potenciais proteínas antibacterianas cuja descoberta e análise permitem o desenvolvimento de novas terapias baseadas em fagos. Devido à elevada resistência aos antibióticos da A. baumannii e às limitadas ferramentas genéticas disponíveis para estudar novas proteínas codificadas por fagos de A. baumannii com função desconhecida, mas com potencial terapêutico, construímos um vetor capaz de expressar em A. baumannii. Para controlar a expressão génica em A. baumannii, foi construído um vetor induzível com regiões promotoras de diferentes operões (lac e ara) de forma a expressar genes repórter (red fluorescent protein, green fluorescent protein). Através de diferentes métodos de validação, como a microscopia, espectrofluorimetria e géis SDS-PAGE, foi possível concluir que o promotor do operão ara expressou melhor as proteínas em A. baumannii. No entanto, a fluorescência apenas se torna significativa quando o gene repórter está com os codões otimizados. A concentração de 0,5% arabinose foi aquela que melhor induziu a expressão proteica. Em conclusão, desenvolvemos novas construções que acomodam a necessidade de análise genética deste patógeno cada vez mais importante.Acinetobacter baumannii, is an aerobic gram-negative bacillus, that exhibits rapid resistance development against antimicrobials, leading to the emergence of Multidrug Resistance (MDR) strains. Due to the widespread resistance to all classes of antibiotics, the World Health Organization (WHO) classified A. baumannii as a critical priority for research of new antibiotics, leading the scientific community to search for new alternatives. Bacteriophages are an alternative extremely studied to combat infections against MDR organisms. Each bacteriophage can encode an arsenal of potential antibacterial proteins and its identification and analysis allow the development of novel phage-based therapies. Given the high antibiotic resistance of A. baumannii and the limited genetic tools available to study new phage-encoded proteins in A. baumannii with unknown function but with therapeutic potential, we constructed an expression vector for A. baumannii. For controlling gene expression in A. baumannii, it was constructed an inducible vector with promoter regions from different operons (lac and ara) to express reporter genes (red fluorescent protein, green fluorescent protein). Through different validation methods such as microscopy, spectrofluorimetry, and SDS-PAGE gels, it was possible to conclude that the promoter from ara operon expressed better the proteins of proteins in A. baumannii. However, the expression was only meaningful after codon-optimization of the codons. The concentration of 0.5 % arabinose was the one that best induced protein expression. In conclusion, we developed novel constructs that accommodate the need in genetic analysis of this increasingly important pathogen