Engineering Saccharomyces cerevisiae for the production of value-added compounds from lignocellulosic biomass

Dissertação de mestrado em BiotecnologiaA crescente demanda de energia e produtos químicos essenciais em diversas atividades do dia a-dia, bem como os efeitos das alterações climáticas e o aumento das emissões dos gases de efeito de estufa, tem vindo a impulsionar a necessidade de substituir os combustíveis fósseis por processos biológicos. Para atingir esse objetivo, é essencial o estabelecimento de biorrefinarias para a produção de biocombustíveis e outros produtos químicos a partir de matérias-primas renováveis, incluindo a biomassa lignocelulósica. O hidroximetilfurfura é um composto versátil e um produto químico atrativo devido às suas propriedades únicas e ampla gama de aplicações. Pode ser reduzido ou subsequentemente oxidado a uma variedade de produtos que possuem uma vasta gama de aplicações, como a síntese de polímeros, síntese de surfactantes e resinas ou para a produção de plastificantes, poliuretano, poliéster ou poliamida, entre outros. A levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido extensivamente estudada pela sua capacidade para destoxificar o HMF. No entanto, a sua capacidade como biocatalisador para gerar derivados de oxidação de HMF não foi suficientemente investigada. Uma estirpe industrial e uma estirpe laboratorial de S. cerevisiae, ambas geneticamente modificadas para produzir HMF/furfural oxedorredutase (HMFH) ou HMF oxidase (HMFO) foram utilizadas como hospedeiras para a oxidação de HMF. Tanto as estirpes recombinantes como as selvagens foram avaliadas quanto à sua capacidade de detoxificar o HMF e a melhor estirpe demonstrou uma conversão eficaz de 50 mM de HMF, resultando na produção de aproximadamente 11 mM de FDCA. Posteriormente, as condições de bioconversão foram otimizadas através da avaliação do impacto das condições de oxigenação. Além disso, o FDCA foi produzido utilizando um hidrolisado hemicelulósico sintético com glucose e frutose como fontes de carbono. Os efeitos do furfural no meio de conversão foram também analisados revelando que a levedura é altamente inibida pela mistura HMF e furfural, demonstrando uma tendência para detoxificar o furfural mais rapidamente. Finalmente, um hidrolisado de bagaço de maçã, previamente submetido a um pré-tratamento com um solvente eutéctico e micro-ondas, foi utilizado como fonte de HMF para bioconversão. A estirpe com melhor desempenho foi capaz de converter aproximadamente 60% de HMF, resultando na produção de derivados com um rendimento de aproximadamente 16% de FDCA, para a melhor condição testada. Estes resultados demonstram que a utilização de um hidrolisado de bagaço de maçã, pela estirpe selecionada, é uma opção viável e sustentável para a bioconversão de HMF usando células inteiras.The escalating demand for energy and chemicals necessary in various daily routines coupled with the effects of climate change and the increase in greenhouse gas emissions has been pushing the need to shift away from fossil fuels to biological processes. To achieve this aim, establishing a biorefinery is essential for producing biofuels and other chemicals from renewable feedstocks, including lignocellu losic biomass. Hydroxymethylfurfural is a versatile compound and an attractive chemical because of its unique properties and multiple applications. It can be reduced or subsequently oxidized to a variety of products, and its derivatives have a wide range of applications such as synthesising polymers, synthesis ing surfactants and resins and producing plasticisers, polyurethanes, polyesters or polyamides, among others. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been extensively investigated for its ability to detoxify HMF, a toxic by-product of hexoses degradation. However, its capability as a whole-cell biocatalyst to produce HMF derivatives, has not been sufficiently investigated. A robust industrial and a laboratory S. cerevisiae strain, both genetically modified to produce HMF/furfural oxidoreductase (HMFH) or HMF oxidase (HMFO) were utilised as hosts for HMF oxidation. The recombinant and wild-type strains were evaluated for their ability to detoxify HMF and I-msHMFO strain demonstrated effective detoxification of 50 mM of HMF, resulting in the production of 11 mM of FDCA. Afterwards, the bioconversion conditions were optimised by evaluating the impact of oxygenation conditions. Furthermore, FDCA was produced using a synthetic hemicellulosic hydrolysate with glucose and fructose as carbon sources. The effects of furfural in the conversion medium were also analysed, revealing that the yeast is highly inhibited by the HMF and furfural mixture and has a tendency to detoxify furfural more rapidly. Finally, an apple pomace hydrolysate that underwent a pretreatment with a deep eutectic solvent and microwave, was utilised as a source of HMF for the bioconversion. The best-performing strain was able to convert approximately 60% of HMF resulting in the production of derivatives with a yield of approx imately 16% of FDCA, for the best condition tested. These results demonstrate that the use of apple pomace hydrolysate by the selected engineered strain is a viable sustainable option for the whole-cell bioconversion HMF