Protease production, partial purification and characterization from Bacillus sp. isolated from Turkish soil

Bu çalışmada Türkiye' nin 21 farklı ilinden temin edilen toprak örneklerinden 54 adet bakteri izole edilmiştir. Proteaz pozitif olarak belirlenen ve en geniş zon çapına sahip olan 6 bakterinin morfolojik ve fizyolojik özellikleri araştırılmış ve hepsinin Bacillus cinsine ait olduğu saptanmıştır. Farklı içerikli iki çeşit ortam, 4 suşun enzim üretim kapasiteleri için test edilmiştir. En yüksek proteaz aktivitesine sahip 1 adet Bacillus suşu seçilmiş ve bu suş, Bacillus sp. N-40 olarak adlandırılmıştır.Bacillus sp. N-40'ın proteaz üretimi üzerine bazı faktörlerin etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla, çeşitli karbon kaynakları, azot kaynakları ve metal iyonları denenmiştir. Bacillus sp. N-40 suşunun maksimum proteaz üretimi, karbon kaynağı olarak fruktoz, azot kaynağı olarak ise yağsız süt tozu (skimmed milk) varlığında gözlemlenmiştir, elde edilen enzim aktivitesi verimi sırasıyla %24 ve %43 olarak belirlenmiştir. İlave edilen metal iyonlarının hiçbiri enzim aktivitesini arttırmamıştır ancak Ca+2'un bakteri üremesinde ve enzim üretiminde etkili olduğu saptanmıştır.Tarafımızdan modifiye edilen ortam, daha yüksek enzim aktivitesi elde etmek için en uygun ortam olup, enzim aktivitesi %51 olarak bulunmuştur. Optimum enzim aktivitesi 55oC'de elde edilmiştir. Termostabilite çalışmaları enzimin 55oC' de, 3 saat sonunda, aktivitesinin %100'ünü koruduğunu göstermiştir. Bundan dolayı, enzim termostabil olabilir. Optimum pH ise 7.0 olarak elde edilmiş ve enzimin, pH skalasının alkali tarafındaki aktivitesinin asidik tarafa göre daha yüksek olduğu bulunmuştur. Dolayısıyla, enzimin alkali bir enzim olduğu söylenebilir. Enzim aktivitesi üzerine Mn+2 ve Ca+2' un stimülatör etkisi gözlemlenmiştir. Enzim, %75 amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz ile kısmi olarak saflaştırılmış ve 2.11 kez saflaştırma sağlanmıştır. Enzimin moleküler ağırlığı yaklaşık olarak 52 kDa olarak tespit edilmiştir.In this study, 54 bacteria were isolated from soil samples that provided from 21 different cities of Turkey. Morphological and physiological features of six bacteria that have the widest zone radius and of the protease positive were investigated and all of them were determined as Bacillus genus. Two kinds of media with a different content were tested their capacity for enzyme production of four strains. One strain that had the highest protease activity was selected and it was named as Bacillus sp. N-40.The effects of some factors on the production of protease by Bacillus sp. N-40 were investigated. For this purpose, various carbon and nitrogen sources and metal ions were tested. As a result, the highest protease activity was observed in the presence of fructose as the carbon source and skimmed milk as the nitrogen source, the yields were 24% and 43%, respectively. None of the additional metal ions were increased the enzyme activity, however, it was observed that Ca+2 had an effect on bacterial growth and the enzyme production.The medium that modified by us, was the most convenient medium to obtain higher enzyme activity and found as 51% enzyme activity. The optimum enzyme activity was obtained at 55oC. Thermostability studies showed that enzyme was retained as 100% after 3 hours at 55oC, therefore it might be a thermostable. The optimum pH was determined as 7.0 and it is observed that the activity of the enzyme is higher at the alkaline side of the pH scala rather than the acidic side. Therefore, it was said that the enzyme was an alkali enzyme. The stimulatory effect of Mn+2 and Ca+2 on the enzyme activity were observed. The enzyme was partially purified with 75% ammonium sulphate precipitation with dialysis and obtained 2.11 fold purification. The molecular weight of enzyme was determinated approximately 52 kDa.TÜBİTAK Marmara Araştırma Merkez