Die Rolle von Leptin bei der Regeneration nach akuter peripherer Nervenschädigung

Akute periphere Nervenschädigungen, durch Traumata oder als Folge von Entzündungen, stellen ein häufiges klinisches Problem dar, denn die sensorischen, motorischen und/oder autonomen Funktionsverluste bestehen oftmals dauerhaft (Panagopoulos et al., 2017). Die zugrundeliegende inadäquate und unvollständige Nervenregeneration beruht auf einem fehlerhaften oder ausbleibenden Wachstum regenerierender Axone und der mit der Zeit verblassenden Kapazität des distalen Nervenstumpfs, die regenerierenden Axone zu unterstützen (Jessen & Mirsky, 2019). Die Anwendung derzeit verfügbarer Therapiestrategien, dabei fast ausschließlich chirurgischer Verfahren, ist zumeist nicht ausreichend, um den Prozess der Nervenreparatur zu verkürzen und eine adäquate Funktion der Nerven wiederherzustellen (Panagopoulos et al., 2017). Im Fokus aktueller Forschung und der vorliegenden Doktorarbeit steht daher die Entwicklung pharmakologischer Therapieansätze, die die chirurgische Versorgung von Nervenläsionen ergänzen könnten. Der schon während der Entwicklung des Nervensystems essentiellen symbiotischen Einheit von Axonen und Schwannzellen kommt im Zuge der Nervenregeneration erneut eine große Bedeutung zu. Nach einer akuten Nervenschädigung wechseln Schwannzellen vom Instandhalten der Axone zum Abbau dieser, bis hin zur Unterstützung des erneuten Aufbaus von Axonen und deren Remyelinisierung (Stassart & Woodhoo, 2021). Vorarbeiten der AG Fledrich haben erstmals eine Beeinflussung der Nervenregeneration über den Leptin-Rezeptor in Schwannzellen aufgezeigt. So ist die Nervenregeneration im Mausmodell nach experimenteller Nervenläsion infolge der konditionalen Ablation des Leptin-Rezeptors in Schwannzellen beeinträchtigt (Manuskript Sundaram & Schütza et al., 2023, siehe Anlagen). Basierend auf dieser Entdeckung wurde für die vorliegende Arbeit in einem loss-of-function-Ansatz eine konditionale Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten durchgeführt, wodurch ein Mangel an Leptin induziert wurde, und dessen Einfluss auf die periphere Nervenregeneration nach akuter Nervenschädigung untersucht. Die elektrophysiologischen und histologischen Analysen zeigten eine verminderte Anzahl regenerierter, funktionsfähiger Axone und somit eine beeinträchtigte periphere Nervenregeneration unter Leptin-Mangel. Demgegenüber wurden wildtypische Mäuse im Anschluss an eine experimentelle Nervenläsion mit pharmakologisch appliziertem Leptin behandelt. Dies resultierte in einer verbesserten Nervenregeneration. Erkennbar wurde dies sowohl in der funktionellen Ganganalyse als auch in den elektrophysiologischen und histologischen Untersuchungen durch die erhöhte Anzahl regenerierter Axone mit verstärkter Remyelinisierung unter Leptin Behandlung. Die Ergebnisse sind neben den Vorarbeiten und erbrachten Folgeexperimenten der AG Fledrich Bestandteil des in den Anlagen beigefügten zur Publikation eingereichten Manuskripts Sundaram & Schütza et al., 2023. In der Zusammenschau lässt sich ableiten, dass Leptin über eine gliale Signalwirkung den Prozess der Nervenreparatur positiv beeinflusst, indem es die Autophagie innerhalb des distalen Nervenstumpfs und das neue Auswachsen der Axone sowie deren Remyelinisierung fördert. Mechanistisch könnte Leptin die Energieversorgung der Reparatur-Schwannzellen durch eine erhöhte Leistung der oxidativen Phosphorylierung und Myelinophagie begünstigen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bilden eine Grundlage für zukünftige Studien mit dem Ziel, das gewonnene Wissen in die klinische Praxis zu überführen und eine pharmakologische Behandlung akuter peripherer Nervenschädigungen zu etablieren.:Abkürzungsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Das periphere Nervensystem 1 1.2 Neurone und Gliazellen 1 1.2.1 Signaltransduktion und Myelinisierung 3 1.2.2 Entwicklung der Schwannzelle und axo-gliale Interdependenz 6 1.3 Akute periphere Nervenschädigungen 9 1.3.1 Degenerationsprozesse 11 1.3.2 Regeneration peripherer Nerven und Remyelinisierung 14 1.3.3 Veränderungen im Metabolismus peripherer Nerven nach akuter Nervenschädigung 17 1.4 Leptin und der Leptin-Rezeptor 20 1.4.1 Physiologische Funktionen von Leptin 20 1.4.2 Leptin und das periphere Nervensystem 23 1.5 Zielsetzung und Fragestellung 25 2 Material und Methoden 27 2.1 Material 27 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 27 2.1.2 Puffer und Pufferlösungen 29 2.1.3 Antikörper 33 2.1.4 Inhibitoren, Enzyme und Hormone 34 2.1.5 Kits 34 2.1.6 Genotypisierungs-Primer 35 2.1.7 Verbrauchsmaterialien 35 2.1.8 Geräte 36 2.1.9 Software 37 2.2 Methoden 39 2.2.1 Versuchstiere 39 2.2.1.1 Identifikation der Tiere 39 2.2.1.2 Tamoxifen-Behandlung 39 2.2.1.3 Implantation der ALZET®-Pumpen und Leptin-Behandlung 40 2.2.1.4 Nervenläsion 42 2.2.1.5 Narkotisierung und Tötung der Versuchstiere 43 2.2.1.6 Probenentnahme und Verarbeitung des biologischen Materials 44 2.2.2 Phänotypisierung mittels DigiGaitTM-Ganganalyse 44 2.2.3 Elektrophysiologische Untersuchung 46 2.2.4 Gewebekultur 47 2.2.5 Histologische Methoden 48 2.2.5.1 Einbettung in Agar 100 Resin 48 2.2.5.2 Anfertigung, Aufnahme und Auswertung von Semidünnschnitten 50 2.2.6 Proteinbiochemische Methoden 51 2.2.6.1 Proteinisolation und -quantifizierung 51 2.2.6.2 SDS-Gelelektrophorese 52 2.2.6.3 Western Blotting und Immundetektion 53 2.2.6.4 Nachweis von Serum-Leptin mittels ELISA 55 2.2.7 Nukleinsäure-Analyse 57 2.2.7.1 Isolation genomischer DNA aus Schwanzproben 57 2.2.7.2 Genotypisierung der DNA mittels PCR 57 2.2.7.3 Agarose-Gelelektrophorese der genomischen DNA 59 2.2.8 Statistik 59 3 Ergebnisse 61 3.1 Ex vivo-Untersuchungen geben Aufschluss über Leistungen der oxidativen Phosphorylierung, Autophagie und β-Oxidation während der Nervendegeneration 61 3.1.1 Die ex vivo-Behandlung mit Leptin steigert die Autophagie-Leistung im degenerierenden Nerv 61 3.1.2 Während der Nervendegeneration ist die Expression von Proteinen der oxidativen Phosphorylierung erhöht 63 3.1.3 Die Blockade der Autophagie reduziert die Expression von Proteinen der oxidativen Phosphorylierung im degenerierenden Nerv 64 3.1.4 Die Inhibition des Komplex I der oxidativen Phosphorylierung führt zur Verminderung der Autophagie-Leistung während der Nervendegeneration 65 3.1.5 Die Blockade der Fettsäureoxidation inhibiert die Autophagie 66 3.2 Die Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten beeinträchtigt die Nervenregeneration 68 3.2.1 Die Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten vermindert den Leptin-Spiegel im Blutserum und erhöht das Körpergewicht der Tiere 68 3.2.2 Die Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten resultiert in einem verringerten Muskelsummenaktionspotential von regenerierenden Nerven 69 3.2.3 Die Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten führt zu einer verminderten Anzahl remyelinisierter Axone in regenerierenden Nerven 71 3.3 Die pharmakologische Behandlung mit Leptin fördert die Nervenregeneration in vivo 73 3.3.1 Die Applikation von Leptin über ALZET®-Pumpen führt zu einer Erhöhung des Leptin-Spiegels im Blutserum und zu einer Reduzierung des Körpergewichts der Tiere 73 3.3.2 Die Gabe von Leptin beschleunigt die Wiederherstellung motorischer Funktionen nach akuter Nervenschädigung 74 3.3.3 Die pharmakologische Gabe von Leptin optimiert die Nervenleitgeschwindigkeit und das Muskelsummenaktionspotential von regenerierenden Nerven 78 3.3.4 Die Behandlung mit Leptin verbessert die Remyelinisierung nach akuter Nervenschädigung 79 4 Diskussion 81 4.1 Die während der Nervendegeneration ablaufenden metabolischen Prozesse stehen in einem Abhängigkeitsverhältnis zueinander und lassen sich durch die Gabe von Leptin beeinflussen 82 4.2 In vivo resultiert die Abwesenheit von zirkulierendem Leptin durch Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten in einer beeinträchtigten Nervenregeneration 84 4.3 Pharmakologisch appliziertes Leptin fördert den Prozess der Nervenregeneration in vivo 85 5 Zusammenfassung 88 Literaturverzeichnis VIII Danksagung XVII Lebenslauf XVIII Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XX Anlagen XX