Étude de l’adhésion des STEC aux globules gras du lait cru : une clé dans la prévention du danger STEC dans la filière lait cru et fromage au lait cru ?

Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), which are associated with large-scale outbreaks, often involve raw or undercooked contaminated food such as raw milk cheeses, meat, and vegetables. Hygiene measures implemented from producer to consumer reduce the risk of food contamination and therefore of STEC infections, but do not eliminate it entirely. The interest in developing novel preventive and therapeutic strategies against this pathotype is evident for the preservation of the food industry and the health of consumers, especially in light of the lack of relevant therapy for STEC infections. This work, supported by the professionals of the French dairy industry, continues the work previously carried out by the team on the anti-adhesive properties of raw milk fat globules against STEC. The prevention of bacterial adhesion is now considered as a promising strategy to reduce the occurrence of infectious diseases. Thus, the goals of this work were (i) to evaluate the association of STEC with raw milk fat globules and the reduction of STEC levels in raw milk through fat removal and (ii) to identify the nature of the STEC-milk fat globule association, including the molecular components of STEC that are involved. To address the first objective, an approach based on a raw milk characteristic, namely creaming, coupled with imaging and mass spectrometry, was developed. To address the second objective, physico-chemical characteristics of STEC strains, such as hydrophobicity and surface charges, as well as the strains' adherence to fat globule membrane proteins were measured. To evaluate the importance of genetic diversity and strain serotype in this phenomenon, most of the experiments were performed on a collection of 15 E. coli strains that belonged to various outbreak serotypes (O157:H7, O26:H11, and O103:H2). Our results demonstrated that all STEC strains showed a definite affinity for raw milk fat globules, although they were variations between strains and serotypes. After verifying that aspecific interactions were weakly involved in the STEC-milk fat globule association, we showed that STEC O26:H11 and O103:H2 bacteria adhered more to milk fat globule membrane proteins, compared to STEC O157:H7 strains. We also demonstrated the involvement of STEC surface proteins in their association with milk fat globules. Furthermore, we noticed that the nature and quantity of proteins expressed by STEC were variable, which could explain the differences in affinity observed between the strains for milk fat globules. More precisely, we identified by mass spectrometry the flagellin and the OmpA porin associated with the protein fraction of the milk fat globule membrane. The involvement of flagellin in STEC adhesion to milk fat globule membrane proteins was highlighted by studying strains that were mutated for these potential adhesins. Bacteria-milk fat globule association has been very little studied on the bacterial side. For the first time, we propose that STEC-milk fat globule adhesion involve a combination of receptor/ligand pairs, present on the surface of STEC and anchored in the milk fat globule membrane. We assume that the specificity of the mechanism would come from the different epitopes recognized by STEC through the different adhesive structures they express. The complete identification of the molecular mechanisms strongly involved in the STEC-milk fat globule association needs to be further investigated.Les Escherichia coli producteurs de shiga toxines (STEC), responsables d’épidémies de grande envergure, impliquent souvent des aliments contaminés consommés crus ou insuffisamment cuits, comme les fromages au lait cru, la viande et les végétaux. Les mesures d’hygiène instaurées du producteur jusqu’au consommateur diminuent le risque de contamination des produits donc d’infections à STEC, mais ne l’élimine pas entièrement. Ajouté à cela l’absence de traitement efficace contre les infections à STEC, l’intérêt du développement de nouvelles stratégies préventives et thérapeutiques contre ce pathogène est indéniable pour le maintien des filières et la santé des consommateurs. Ce travail, soutenu par les professionnels de la filière laitière française, poursuit des travaux préalablement menés par l’équipe sur les propriétés anti-adhésives des globules gras du lait cru contre les STEC. La prévention de l'adhésion bactérienne est maintenant considérée comme une stratégie prometteuse pour réduire l’apparition des maladies infectieuses. Les objectifs de ce travail étaient (i) d’évaluer l’association des STEC avec les globules gras du lait cru et la réduction du niveau des STEC dans le lait cru via l’élimination de la matière grasse et (ii) d’identifier la nature de l’association STEC-globules gras et les composants moléculaires des STEC impliqués dans l’association. Pour répondre au premier objectif, une approche basée sur une propriété naturelle du lait cru, le crémage, couplée à l’imagerie et à la spectrométrie de masse, a été développée. Pour répondre au second objectif, la mesure de propriétés physico-chimiques de souches STEC telle que l’hydrophobicité et les charges de surface ainsi que l’évaluation de l’adhésion des souches pour les protéines de la membrane des globules gras ont été entrepris. Afin d’évaluer l’importance de la diversité génétique et le sérotype des souches dans ce phénomène, la majeure partie des expérimentations a été réalisée sur une collection de 15 souches d’E. coli appartenant à plusieurs sérotypes responsables d’épidémies (O157:H7, O26:H11 et O103:H2). Nos travaux ont démontré que toutes les souches STEC présentaient une affinité certaine pour les globules gras du lait cru, mais qu’elle différait selon les souches et le sérotype. Après avoir vérifié que les interactions aspécifiques étaient faiblement impliquées dans l’association STEC-globule gras, nous avons montré que les souches STEC O26:H11 et O103:H2 adhéraient davantage aux protéines de la membrane des globules gras, en comparaison avec les souches STEC O157:H7. Nous avons aussi démontré l’implication de protéines de surface des STEC dans leur association avec les globules gras. Par ailleurs, nous avons remarqué que la nature et la quantité des protéines exprimées par les souches étaient variables entre elles, ce qui pourrait expliquer les différences d’affinité observées entre les souches, pour les globules gras. Plus précisément, nous avons identifié par spectrométrie de masse, la flagelline et la porine OmpA associée à la fraction protéique de la membrane des globules gras. La caractérisation des souches STEC mutées pour ces adhésines potentielles, a mis en lumière l’implication de la flagelline dans l’adhésion des STEC aux protéines de la membrane des globules gras. L’étude de l’association bactéries-globules a très peu été étudiée du côté des bactéries. Pour la première fois, nous mettons en avant que l’adhésion STEC-globules gras semblerait impliquer une combinaison de couples récepteur/ligand, présents à la surface des STEC et ancrées dans la membrane des globules gras. Nous supposons que la spécificité du mécanisme proviendrait des différents épitopes reconnus par les STEC grâce aux différentes structures adhésives qu’elles expriment. L’identification complète des acteurs moléculaires fortement engagés dans l’association STEC-globule gras doit encore être approfondie