Un nanopore d’ADN pour la détection d’oligonucléotides courts

DNA nanopores incorporated into artificial lipid bilayers are currently used in biosensing and sequencing. In this thesis, we investigate their ability to detect short oligonucleotides, such as DNA analogues of microRNA, fluctuations of lipid membrane structure caused by the insertion and desorption of nanopores bound to the target oligonucleotides are used to make precise measurements of the conductance of the bilayer formed at the intersection of two liquid droplets (DIB) and eventually monitor the concentration of target oligonucleotides.Chapter 1 provides a general introduction of artificial lipid bilayers as well as three types of nanopores. An overview of microRNA detection methods is provided, along with extensive information on DNA nanopore detection approaches.Chapter 2 introduces the experimental methods of this thesis.Chapter 3 introduces laboratory work on the conformation of a ‘cork’ nanopore formed by the assembly of 42-nucleotides-long six-helix bundles and illustrates the experimental setup of the DIB approach (formation and characterization of DIBs). Results from coarse-grained oxDNA simulations, Atomic force microscopy experiments (AFM), gel electrophoresis experiments, and fluorescent experiments to characterize this cork nanopore are reported. Also a discussion about the conductance measurements in current recording experiments is given.Chapter 4 describes a DNA origami (T1) structure which combines a six-helix-bundle nanopore with a planar rectangular 2D-DNA origami. In addition, current recordings in the absence and presence of targets are described. We also report a further optimized structure of DNA origami (T2) obtained by generating a nanopore and a 2D platform with a single scaffold. Results from experiments to characterize the structure and to investigate the bilayer conductance in current recording measurements, as well as the interaction with supported lipid bilayers in quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) experiments, are presented.Chapter 5 presents some conclusions and perspectives.Les nanopores d'ADN incorporés dans des bicouches lipidiques artificielles peuvent être utilisés dans la biodétection et le séquençage. Dans cette thèse nous avons exploré la possibilité pour ces structures de détecter des séquences d’oligonucléotides courts, tels que des microARN. Les fluctuations de la structure membranaire causées par l'insertion et la désorption des nanopores sont utilisées pour effectuer des mesures précises de la conductance de la bicouche formée à l’intersection entre deux gouttes liquides (DIB) et pour mesurer la concentration d'oligonucléotides hybridés avec les nanopores d'ADN.Le chapitre 1 fournit une introduction générale des bicouches lipidiques artificielles ainsi que trois types de nanopores. Un aperçu des méthodes de détection de microARN est fourni, ainsi que des informations détaillées sur les méthodes de détection des nanopores d'ADN.Le chapitre 2 présente les méthodes expérimentales utilisées dans notre thèse.Le chapitre 3 présente des expériences réalisées sur un nanopore formé par six hélices de 42 nucléotides de long et illustre la configuration expérimentale de l'approche DIB en manipulant mécaniquement la bicouche lipidique. Les résultats de simulations de dynamique moléculaire (oxDNA), des expériences de microscopie à force atomique (AFM), des expériences d'électrophorèse sur gel et des expériences de fluorescence sont rapportés. Et une discussion sur les mesures de conductance est donnée.Le chapitre 4 décrit les perturbations dans la conductance d’une bicouche induites par un origami d'ADN (T1) combinant un nanopore à six hélices avec un origami d'ADN 2D rectangulaire planaire. Nous considérons également une autre structure optimisée origami d'ADN (T2) obtenue en générant un nanopore relié directement à une plate-forme 2D. Les résultats de caractérisation électriques (mesure de la conductance) ainsi que l'interaction avec une bicouche lipidique supportée à l’aide d’une microbalance de quartz avec mesure de la dissipation (QCM-D), sont également présentés.Le chapitre 5 présente des conclusions et quelques perspectives