Étude in vivo de la topologie de l'ADN chez l'archée hyperthermophile Thermococcus kodakarensis

In all cells the DNA exists in supercoiled form. Topoisomerases regulate the DNA supercoiling allowing essential processes such as transcription or replication to occur. In course of my thesis I focused on DNA gyrase which is unique by its capacity to supercoil DNA negatively. Previous studies suggested that this enzyme was transferred from Bacteria to Archaea via a single HGT. This acquisition must have had completely changed the DNA topology of the recipient archaeon, thus impacting all DNA transactions. I therefore asked how this naïve archaeon could accommodate an active gyrase and what was the associated evolutive advantage? To tackle this question I undertook an integrative approach using phylogenetic analysis, genetic engineering and genome wide analyses.I showed that gyrase was acquired relatively late in the history of Archaea and that this event was followed by a limited expansion through rare secondary transfers. To mimic the ancestral transfer, I expressed a bacterial gyrase in the naïve archaeon Thermococcus kodakarensis, whichnaturally has positively supercoiled DNA. I demonstrated that the gyrase was active in T. kodakarensis leading to strong negative supercoiling of plasmid DNA. Surprisingly, the drastic change of DNA topology, while mildly deregulating the expression of hundreds of genes, did not affect growth of T. kodakarensis. Notably, the endogenous topoisomerases were not deregulated suggesting existence of uncommon resilience mechanisms against torsional stress in this archaeon. To test this hypothesis, I established psoralen crosslinking assay to directly map supercoiling on the chromosome of T. kodakarensis. Coupled with next generation sequencing, this technique will allow us to map for the first time the distribution of supercoiling at the chromosome scale in an archaeon. My thesis work now provides the necessary tools to investigate how DNA supercoiling is distributed and maintained in hyperthermophiles and in archaea in general.Au sein des cellules, l’ADN existe dans un état surenroulé. Les topoisomérases régulent le surenroulement de l’ADN pour permettre aux processus essentiels, comme la transcription ou la réplication, d’avoir lieu. Au cours de ma thèse je me suis intéressé à la gyrase qui est unique par sa capacité de surenrouler l’ADN négativement. Des études antérieures suggèrent qu’un transfert horizontal de gènes depuis les bactéries a permis l’implantation de la gyrase chez les Archées. L’acquisition d’une telle activité doit avoir profondément bouleversé la topologie de l’ADN d’archée receveuse. Comment cette archée « naïve » a pu intégrer une gyrase et quels ont été les avantages évolutifs associés ? Pour aborder cette question, j’ai mis en oeuvre une approche intégrative, mêlant analyses phylogénétiques, génie génétique et techniques d’analyse du génome dans sa globalité. J’ai montré que la gyrase a été acquise tardivement dans l’histoire des Archées et que cet unique événement a été suivi par une expansion limitée viade rares transferts secondaires. Pour mimer le transfert ancestral, j’ai exprimé une gyrase bactérienne dans l’archée Thermococcus kodakarensis, qui en est dépourvue et présente un surenroulement de l’ADN positif. J’ai pu démontrer que la gyrase introduit un surenroulement négatif important dans l’ADN de T. kodakarensis. Ce bouleversement topologique dérégule l’expression de nombreux gènes, mais pas les topoisomérases endogènes, et n’a pas d’impact sur la croissance de T. kodakarensis. Cela indique l’existence chez cette archée, de mécanismes permettant de résister efficacement au stress topologique. Pour tester cette hypothèse, j’ai mis au point la technique de pontage au psoralène, qui permet de cartographier le surenroulement directement sur le chromosome, chez T. kodakarensis. Couplées à un séquençage à haut débit, ces données permettront pour la première fois de décrire en détail la répartition du surenroulement à l’échelle du chromosome chez une archée