GDNF/RET signaling and its downstream pathways eliminate alpha-synuclein pathology in dopamine neurons

Main cellular pathologies of Parkinson’s disease are demise of midbrain dopamine neurons and abnormal inclusions inside neurons and neurites called respectively, Lewy bodies and Lewy neurites. The alpha-synuclein protein was one of the first components identified in Lewy bodies. Though the exact link between alpha-synuclein and neurodegeneration is unclear, it is well-established that alpha-synuclein is important for both hereditary and spontaneous Parkinson’s disease. There is convincing evidence for the spreading of alpha-synuclein pathology between neurons. In agreement with the systemic nature of the disease, the pathology is found in the other organs outside of the central nervous system. Currently, there are no treatments against the progressive neurodegeneration or alpha-synuclein pathology in Parkinson’s disease. Neurotrophic factors hold great promise for preserving the neurons. Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protects dopamine neurons against toxin-based animal models of neurodegeneration. Research related to GDNF and alpha-synuclein has been controversial and limited to genetic models of Parkinson’s disease. However, these genetic models cannot be generalized, especially since Lewy pathology observed in the people’s brains does not depend on the genetic mutations and can occur sporadically. It is crucial to study the relationship between GDNF and alpha-synuclein aggregation with more comprehensive models of alpha-synuclein pathology. To study the effect of GDNF on alpha-synuclein aggregation, we scaled up micro island cultures of primary mouse midbrain cells in 96-well plates. Alpha-synuclein pre-formed fibrils (PFFs) were used to induce Lewy body- and neurite-like inclusions in dopamine neurons. Delivered up to four days after PFFs, GDNF – protein or gene expression – decreased alpha-synuclein aggregation in midbrain dopamine neurons. In vivo, viral vector-mediated overexpression of GDNF in the mouse substantia nigra prevented alpha-synuclein inclusions in this brain region. Primary midbrain cells treated with PFFs were used to inspect the role of GDNF’s main signaling receptor, rearranged during transfection (RET), and its downstream signaling pathways. A neuron-specific CRISPR/Cas9 system was used to knock out RET for nulling GDNF’s protective effect against alpha-synuclein aggregation. Drug-mediated inhibition of SRC led to comparable results as knocking out RET, whereas inhibition of the phosphoinositositide-3-kinase (PI3K)/AKT pathway increased the ratio of inclusion bearing dopamine neurons, without significant loss of GDNF’s effect on alpha-synuclein aggregation. None of the treatments, except specific AKT inhibition, were harmful for the cultured dopamine neurons. To co-study neurodegeneration and alpha-synuclein pathology, the proteasome inhibitor lactacystin was assessed together with PFFs. Although GDNF failed to protect cultured dopamine neurons against lactacystin-induced neurodegeneration, it continued to eliminate alpha-synuclein pathology both in vitro and in vivo. The robust effect of GDNF against alpha-synuclein aggregation signifies the importance of neurotrophic factors and their signaling pathways for neuroprotection. These findings could promote a basis for the development of target-specific treatments against Parkinson’s disease and other disorders with alpha-synuclein pathology.Parkinsonin taudin tärkeimmät solupatologiset löydökset ovat keskiaivojen dopamiinihermosolujen häviäminen ja epänormaalit proteiinisakkaumat hermosolujen sisällä, mitä kutsutaan Lewyn kappaleiksi ja Lewyn neuriiteiksi. Alfa-synukleiini on yksi ensimmäisistä Lewyn kappaleissa tunnistetuista proteiineista. Vaikka tarkka yhteys alfa-synukleiinin ja neurodegeneraation välillä on edelleen epäselvä, tutkijoiden keskuudessa on yleisesti hyväksytty, että alfa-synukleiini on tärkeä sekä perinnölliselle että yleiselle Parkinsonin taudille. Alfa-synukleiinipatologian leviämisestä hermosolujen välillä on vakuuttavia todisteita. Taudin patologisia löydöksiä on myös keskushermoston ulkopuolisissa elimissä. Tällä hetkellä Parkinsonin taudin etenevään hermorappeumaan tai alfa-synukleiinipatologiaan ei ole taudin kulkua hidastavia lääkehoitoja. Hermosolujen kasvutekijät ovat olleet lupaavia molekyylejä uudeksi terapiamuodoksi, koska niillä on hermosolujen eloonjäämistä edistäviä vaikutuksia. Gliasolulinjaperäinen hermokasvutekijä (GDNF) suojaa dopamiinihermosoluja hermomyrkyiltä hermosolujen rappeuttavissa tautimalleissa. GDNF:n vaikutukset alfa-synukleiiniin patologisiin vaikutuksiin ovat olleet kiistanalaisia ja tutkimukset ovat rajoittuneet Parkinsonin taudin geneettisiin malleihin. Tuloksia näistä geneettisistä malleista on vaikea yleistää, koska ihmisten aivoissa havaittu Lewy-patologia ei riipu geneettisistä mutaatioista ja patologiaa voi esiintyä satunnaisesti. On ratkaisevan tärkeää tutkia GDNF:n ja alfa-synukleiiniaggregaation välistä suhdetta lisää ja eri alfa-synukleiinipatologian malleilla. Tutkiaksemme GDNF:n vaikutusta alfa-synukleiinin sakkaamiseen käytimme hiiren primäärisiä keskiaivosolujen viljelmiä 96-kuoppalevyillä ja käytimme uutta mikrosaariviljelytekniikkaa. Alfa-synukleiinin ennalta muodostettuja fibrillejä (PFF:itä) käytettiin aikaansaamaan solujen oman alfa-synukleiinin sakkaaminen ja Lewyn kappaleiden kaltaisten sakkaumien kehittyminen dopamiinihermosoluissa. GDNF annettuna jopa neljä päivää PFF:ien jälkeen vähensi alfa-synukleiinin aggregaatiota keskiaivojen dopamiinihermosoluissa. In vivo virusvektorin välittämä GDNF:n ilmentyminen hiiren mustatumakkeessa esti alfa-synukleiinin sakkaumien kehittymisen tälle aivoalueella. PFF:llä käsiteltyjä primäärisiä keskiaivosoluja käytettiin selvittämään GDNF:n signalointireittejä. Väitöskirjatutkimuksessani havaitsimme, että RET-reseptori välitti GDNF:n vaikutukset Lewyn kappaleen patologian vähentämiseen. Tutkimuksessa kehitin hermosoluspesifisen geenisaksityökalun (CRISPR/Cas9) ja sen avulla poistettiin RET ja GDNF:n suojaavat vaikutukset alfa-synukleiinin sakkaamiseen. Käyttäen pienimolekyylisiä yhdisteitä havaitsimme, että RET:n signaalireiteistä erityisesti SRC:n esto oli tärkeä GDNF:n vasteessa. Neurodegeneraation ja alfa-synukleiinipatologian tutkimiseksi käytimme proteasomi-inhibiittori laktakystiinia ja sitä käytetttiin yhdessä PFF:ien kanssa. Vaikka GDNF ei onnistunut suojaamaan viljeltyjä dopamiinihermosoluja laktakystiinin aiheuttamaa hermoston rappeutumista vastaan, se esti alfa-synukleiinipatologiaa sekä in vitro että in vivo. GDNF:n voimakas vaikutus alfa-synukleiinipatologiaa vastaan osoittaa hermokasvutekijöiden ja niiden signalointireittien tärkeyden hermosolujen suojauksessa. Väitöskirjatutkimukseni havainnot edistävät spesifisten lääkehoitojen kehittämistä Parkinsonin tautia ja muita alfa-synukleiinipatologioita vastaan