Terveeltä ulosteenluovuttajalta eristettyjen, potentiaalisesti terapeuttisten bakteerien karakterisointi

Tiivistelmä Tiedekunta: Maatalous-metsätieteellinen tiedekunta* ja Lääketieteellinen tiedekunta *koordinoiva tiedekunta Koulutusohjelma: Mikrobiologian ja mikrobibiotekniikan maisteriohjelma Tekijä: Johanna Potila Työn nimi: Terveeltä ulosteenluovuttajalta eristettyjen, potentiaalisesti terapeuttisten bakteerien karakterisointi Työn laji: Maisterintutkielma Kuukausi ja vuosi: Elokuu 2023 Sivumäärä: 40 Avainsanat: Clostridioides difficile, dysbioosi, ulosteensiirto, uuden sukupolven probiootit, adheesio, tulehdusvaste Ohjaajat: FT Kaisa Hiippala, FT, dosentti Reetta Satokari ja FT Pauliina Lankinen Säilytyspaikka: E-thesis Helsingin yliopisto Tiivistelmä: Uusiutuva Clostridioides difficile -infektio on antibioottiripuli, joka aiheuttaa merkittävää sairastavuutta ja kuolleisuutta. Ulosteensiirto on tehokkain hoito uusiutuvaan C. difficile- infektioon, sillä hoitovaste on yli 90 %. Ulosteensiirtoon liittyy kuitenkin riskejä, kuten patogeenien tai mikrobistoon liitettyjen sairauksien siirtymisen riski luovuttajien seulonnasta huolimatta. Suolistosta eristettyjen bakteerikantojen sekoituksia voidaan todennäköisesti käyttää tulevaisuudessa ulosteensiirron sijaan, jotta voidaan vähentää ulosteensiirtoon liittyviä riskejä ja parantaa hoidon saatavuutta. Tässä työssä karakterisoitiin 12 aiemmin ulosteenluovuttajalta eristettyä bakteerikantaa. Ensin tutkittiin bakteerien kykyä kasvaa eri elatusaineissa ja niiden hapensietokykyä. Työn toisena tarkoituksena oli selvittää, ovatko isolaatit turvallisia käyttää bakteeriterapiassa. Tämä tehtiin havainnoimalla bakteerikantojen hemolyysiominaisuuksia, antibioottiherkkyyksiä ja tulehdusta aiheuttavia (proinflammatorisia) ominaisuuksia epiteelisoluissa. Kolmantena tavoitteena oli tutkia, onko bakteerikannoilla hyödyllisiä ominaisuuksia, kuten kykyä kiinnittyä mukukseen tai suoliston epiteelisoluihin tai tulehdusta hillitseviä (anti-inflammatorisia) vaikutuksia epiteelisoluihin. HT-29- ja Caco-2-solulinjoja käytettiin mallintamaan suoliston epiteelisoluja. Isolaatit kasvoivat hyvin YBHI (brain heart infusion -elatusaine täydennettynä 0,5 % hiivauutteella) -agarilla ja liemessä ja yli puolet bakteerikannoista kasvoi neljän tunnin happialtistuksen jälkeen. Kaikki isolaatit olivat ei-hemolyyttisiä ja suurin osa niistä oli herkkiä monille yleisesti käytettäville antibiooteille, kuten piperasilliini/tatsobaktaamille ja amoksisilliini/klavulaanihapolle. Epiteelin tulehdusta aiheuttavia (proinflammatorisia) vaikutuksia ei havaittu, sillä interleukiini 8:n (IL-8) vapautumisen indusointi HT-29 soluissa oli vähäistä. Bakteerikannat vaikuttavat siis turvallisilta bakteeriterapiakäyttöön. Isolaattien kiinnittyminen mukukseen ja epiteelisoluihin (Caco-2, HT-29) oli lievää tai kohtalaista (2-7 %), mikä voi mahdollisesti edesauttaa niiden kolonisoitumista suolistossa. Isolaatit eivät hillinneet Escherichia coli lipopolysakkaridin (LPS) indusoimaa tulehdusvastetta HT-29 soluissa eli niillä ei näytä olevan tulehdusta hillitseviä (anti-inflammatorisia) vaikutuksia. Niillä voi kuitenkin olla suolistossa muita hyödyllisiä rooleja, esimerkiksi osana suoliston ravinneverkkoja. Johtopäätöksenä todettakoon, että karakterisoidut isolaatit voisivat soveltua bakteeriterapiakäyttöön uusiutuvan C. difficile infektion hoidossa.Abstract Faculty: Faculty of Agriculture and Forestry* and Faculty of Medicine *coordination Degree programme: Master′s program in Microbiology and Microbial Biotechnology Author: Johanna Potila Title: Characterization of potentially therapeutic bacteria from a healthy fecal donor. Level: Master′s thesis Month and year: August 2023 Number of pages: 40 Keywords: Clostridioides difficile, dysbiosis, FMT, next-generation probiotics, adhesion, anti-inflammatory Supervisors: PhD Kaisa Hiippala, PhD, Docent Reetta Satokari and PhD Pauliina Lankinen Where deposited: E-thesis University of Helsinki Abstract: Recurrent Clostridioides difficile infection (rCDI) is a healthcare-associated infection related to antibiotic use, that causes significant morbidity and mortality. Fecal microbiota transplantation (FMT) is the most effective treatment for rCDI and it is successful in nearly 90% of patients. However, there are some risks related to FMT use such as the potential risk of transferring pathogens or other phenotypes despite donor screening. Defined bacterial mixtures consisting of endogenous commensal gut microbes with beneficial properties could be used instead of FMT to mitigate the risks and improve the availability of the treatment. 12 bacterial strains previously isolated from a healthy fecal donor were characterized in this study. At first, oxygen tolerance and culturability of the isolates in several different media were examined. The second aim was to investigate if these isolates are safe for bacteriotherapeutic use by testing hemolytic properties, antibiotic susceptibilities and proinflammatory properties. The third objective was to investigate potential beneficial properties such as adherence of the isolates to mucus and epithelial cell lines and anti-inflammatory effects on epithelial cells. Caco-2 and HT-29 cell lines were used as a model of intestinal epithelial cells. Growth was abundant on standard brain heart infusion (BHI) medium supplemented with 0,5% yeast extract and more than half of the isolates tolerated the 4-hour oxygen exposure. These results suggest that many of the strains have good production characteristics. All 12 isolates were non-hemolytic and most of them were susceptible to many commonly used anti-microbials such as amoxycillin/clavulanic acid and piperacillin/tazobactam. Low induction of interleukin-8 (IL-8) release from HT-29 cells was observed for all the isolates which indicates no pro-inflammatory effect. These safety tests suggest that the isolates are safe for therapeutical use. Adhesion to mucus and intestinal epithelial cells (HT-29, Caco-2) was low to moderate (2-7%), which can potentially promote their colonization in the gut. No attenuation of Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS)-induced IL-8 release from HT-29 cells was observed, which indicates that characterized strains do not have anti-inflammatory effects on epithelial cells. However, it is likely that they have some other important roles in the gut e.g., in cross-feeding networks and can thus help with restoration of a healthy, diverse gut ecosystem. In conclusion, the characterized isolates could be suitable for bacteriotherapeutic use in the treatment of rCDI