内モンゴル塩湖から単離されたHalorubrum sp. ejinoorの持つロドプシン類タンパク質の研究

細菌ロドプシン類はレチナールを発色団として持ち、光を受容すると、まず発色団が構造変化を起こし、次いでタンパク質の構造変化を誘発する。細菌ロドプシン類は世界各地から見つかっている。中国内モンゴル自治区には多くの塩湖が存在するが、それらの塩湖から細菌ロドプシン類が検出されたという報告はなかった。本研究では中国の内モンゴルにある塩湖（エジノル）から持つ細菌ロドプシンタンパク質遺伝子を持つ好塩菌を単離して調べた。中国内モンゴル・エジノル塩湖の湖水をフィルター濾過して細菌を集め、好塩菌を寒天培地に広げ、そのコロニーを分離した。単離されたコロニーからゲノムDNAを抽出し、16S rRNA遺伝子を増幅した。増幅された16S rRNA遺伝子配列を決定したところ、その配列はHalorubrum chaoviator のものと最も相同性が高かったので、単離した好塩菌をHalorubrum sp. ejinoor (He)と名付けた。HeからゲノムDNAを抽出し、全ゲノム解析を行った。その結果、三種類の細菌ロドプシン類タンパク質遺伝子、BR-like（HeAR）、HR-like（HeHR）、SRII-like（HeSRII）を見つけた。それらのタンパク質遺伝子に対してQuantitative RT-PCRを行った結果、菌体中でのmRNAの比率がHeAR : HeHR : HeSRII : HeHtrII = 30 : 10 : 1 : 1であることを明らかにした。次に、菌体膜から凍結融解法により菌体膜小胞を作製し、その光駆動ポンプ活性を調べた。菌体膜小胞を4M NaClに懸濁し、590nmの光で照射すると、外液のアルカリ化が観察された。菌体膜小胞液に10 uM CCCPを入れると光照射に伴う外液のアルカリ化は大きくなった。10 uM TPP存在下では外液の酸性化が観察された。菌体膜小胞をクロライドイオンがない条件（3M NaNO3）で光照射すると外液の酸性化が観察された。以上の結果より菌体膜小胞にはHRと同様のクロライドイオンポンプ活性とBRと同様のプロトンポンプ活性があると結論できた。Halobacterium salinarum（Hs）の紫膜を分離するのと同様に60～30％のショ糖溶液のステップ密度勾配で超遠心を行い、菌体膜の分離を試みた。Heの膜はHsのように明瞭に2層には分かれなかった。このことより、HeARは紫膜様の膜構造はとらないものと結論された。レーザー閃光分光法で菌体膜の光反応を410 nm、670 nm、540 nm、570 nmの波長で追跡したところ、BRのようなM中間体の生成・崩壊を示す吸光度変化を観察できた。さらにクロライドイオンがある条件下と無い条件下での510nmでの吸光度変化が大きく異なることからHRの存在が示唆された。次に発現精製したタンパク質を得て、より詳細にそれらの性質を調べることにした。 HeARを大腸菌で発現した。Niカラムより精製したARは紫色で、SDS-PAGE解析では分子量が27 kDaであり、予測した分子量と一致した。吸収極大波長は555 nmであった。CDスペクトルより精製したARが0.15% DDMを含むバッファ中で三量体構造を持つことが分かった。精製したARは明暗順応を行うので、発色団レチナールの異性体構造を調べた。また、レーザー閃光分解解析から光反応を追跡したところ、(K)、M、N、O中間体を持ち、光反応サイクル時間が70 ms であることを明らかにした。 HeAR遺伝子を発現させた大腸菌では、光照射に伴う、外液の酸性化が観察された。この結果は、HeARがプロトンポンプ細菌ロドプシンであることを示している。Microbial rhodopsins belong to the large family of retinal protein, a family of photoactive protein which has seven trans-membrane helices and a retinal molecule binding to a lysine residue in the seventh helix via the Schiff base as the photoactive center. Because of structural simplicity and functional diversity, microbial rhodopsins have been an excellent model system for structural biology. In this study, a bacterial strain was collected and identified from a salt lake in Inner Mongolia of China. According to the sequence of 16S rRNA gene of the bacterium the strain belongs to Halorubrum genus and was named Halorubrum sp. ejinoor (He). Three kinds of microbial rhodopsin genes, BR-like (HeAR), HR-like (HeHR) and SRII-like (HeSRII) were identified in He by a whole genome DNA analysis of the bacterium. The mRNAs of three types of microbial rhodopsin genes were detected by RT-PCR and their amounts were determined by quantitative RT-PCR. The amount of mRNA of these genes in He was HeAR : HeHR : HeSRII = 30 : 10 : 1. Measurements of light-induced ion transportation of membrane vesicles suggest the existence of a proton pumping activity and a chloride pumping activity in membrane vesicles of He. He membrane fraction was isolated from cell membrane of the bacterium by sucrose density gradient centrifugation method similar to that for isolation of purple membrane from Halobacterium salinarum. The kinetics of the light-induced absorbance changes of the membrane fraction of He suggested the presence of M-like intermediate (HeAR) and L-like intermediate (HeHR).HeAR, a light-driven proton pump of Halorubrum sp. ejinoor was heterologously expressed in Escherichia coli. The expressed HeAR showed purple colour in the E. coli membrane and was purified by Ni-chelate chromatography. The purified HeAR shows a light-dark adaptation. After illumination, the purified HeAR showed a spectral redshift from 555 to 565 nm, suggesting an increase in the all-trans retinal content. The HPLC analysis revealed that the spectral shift accompanies with the change in retinal contents from 66% all-trans and 34% 13-cis in the dark to 85% all-trans and 15% 13-cis after illumination. The time courses of the absorbance change of HeAR suggested the presence of (K), M, N and O intermediates similar to those of BR-system. The half-life of the M intermediate was estimated as 0.001 s, faster than that in BR (0.005 s). But the photocycling rate was slower than BR. The measurements of light-induced pH changes of the E. coli cell suspensions containing HeAR revealed that HeAR is a light-driven proton pump.室蘭工業大学 (Muroran Institute of Technology)博士（工学