Variabilidad genética en Raulí (Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. et Mil. su relación con procesos evolutivos y su importancia en la conservación y utilización de sus recursos genéticos

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Biológicas, de la Universidad Nacional del Comahue, en 2001El Raulí, Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. et Mil., es una de las especies arbóreas de los bosques Andino-patagónicos de importancia ecológica y económica. Su distribución en Argentina es muy reducida y relativamente fragmentada. Abarca una estrecha franja entre 39º 25´ S y 40º 35´ S que no supera los 40 km en su ancho máximo, siguiendo los valles de las distintas cuencas lacustres de origen glacial. La sobreexplotación de la que fue objeto en el pasado por la calidad de su madera, agravada por sobrepastoreo e incendios forestales recurrentes llevaron a una situación crítica a muchas de las poblaciones de la especie, lo cual derivó en la necesidad de implementar programas de conservación y mejoramiento genético. El primer paso en dichos programas es conocer la intensidad y patrón de distribución de la variación genética de las poblaciones. Los objetivos principales de esta tesis son conocer dicha variación y relacionarla con procesos evolutivos, principalmente el flujo génico, la hibridación y el efecto de las últimas glaciaciones por la drástica reducción de las masas boscosas. La distribución natural de la especie restringida a las cuencas lacustres y la unidireccionalidad de los fuertes vientos en sentido oeste-este dentro de cada cuenca sugieren una diferenciación genética en sentido latitudinal con la posibilidad de un flujo génico extensivo que homogeneice la variación genética dentro de las cuencas. Con el objetivo de estudiar la variación genética dentro y entre poblaciones y con la intención de poner a prueba la hipótesis planteada arriba, se recolectaron semillas durante cuatro años consecutivos en 28 poblaciones de Raulí abarcando todo su rango de distribución natural en Argentina. A modo comparativo, se estudiaron semillas provenientes de tres localidades de Chile. En primer lugar se analizaron, en todas las poblaciones y años recolectados, características seminales como la producción total de semillas por unidad de superficie, el peso de mil semillas y la proporción de daño por insectos. La variación en estas características tiene una influencia ambiental muy importante por lo que brinda información sobre procesos adaptativos de las poblaciones. Todas las características seminales analizadas fueron altamente variables tanto a nivel espacial (entre poblaciones) como temporal (entre años), existiendo interacción entre las poblaciones y los años tanto para el peso de las semillas como para el daño ocasionado por insectos. A su vez, se detectaron correlaciones significativas con variables geográficas como la latitud y la longitud. En particular, el peso de las semillas mostró una variación latitudinal, siendo las semillas de las poblaciones del norte significativamente más pesadas que las del sur. En una segunda etapa se estudió la variación genética en 20 poblaciones de la especie mediante la utilización de marcadores génicos isoenzimáticos. Si bien en general se asume que las variantes aloenzimáticas son selectivamente neutras, se han descripto numerosas excepciones. Por ende, la variación detectada en estos marcadores podría tener alguna implicancia adaptativa. El primer paso de este estudio consistió en la determinación de los marcadores mediante el análisis genético de las variantes fenotípicas observadas. A tal fin se cosecharon yemas de 55 árboles madre y su descendencia (semillas) de polinización abierta. Se probaron distintos sistemas enzimáticos encontrándose buena resolución y variación en seis de ellos. Se detectaron los árboles madre supuestamente heterocigotas para cada locus putativo y se analizaron al menos 100 semillas de los mismos. Se puso a prueba la hipótesis de segregación 1:1 de las variantes detectadas. Con este método se determinaron ocho loci marcadores. La superposición de zonas de actividad en los zimogramas de algunos sistemas enzimáticos, la existencia de bandas dobles o triples para genotipos homocigotas y la hibridación natural con Roble Pellín resaltan la importancia del análisis genético previo a la utilización de las variantes fenotípicas como marcadores génicos. Con los marcadores determinados se analizaron la diversidad y diferenciación genéticas en las 20 poblaciones de Raulí de Argentina y tres de Chile. Por otro lado se analizaron 390 individuos adultos (yemas) de Raulí y Roble Pellín: 100 de cada especie en zona pura y 100 de Roble Pellín y 90 de Raulí de zona de simpatría. Este estudio confirmó la existencia de dos loci enzimáticos que poseen alelos especieespecíficos (Adh y Pgi), permitiendo el seguimiento del proceso de hibridación entre ambas especies. En cada población se estudió un mínimo de 100 semillas. Se detectaron altos niveles de variación intrapoblacional con un número medio de alelos (AL) de 3,38, diversidad génica (V) de 1,29, heterocigosis observada (Ho) y esperada (He) de 15,9 % y 18,1 % respectivamente. La diferenciación de cada población respecto a las restantes (Dj) varió entre 2,4 % y 8,1 % siendo el valor medio de diferenciación entre poblaciones (8) de 4,7 %. Todos estos parámetros fueron variables entre las poblaciones, incluso entre aquellas cercanas y pertenecientes a una misma cuenca lacustre. Las poblaciones más diferenciadas se encontraron en el sector occidental de la distribución, mientras que las mayores proporciones de semillas híbridas se observaron entre las poblaciones del este, detectándose altos porcentajes de retrocruzas en algunas de ellas. Las poblaciones de Chile mostraron niveles menores de variación. Se analizó también la variación temporal en el sistema de apareamiento y su influencia en la estructura genética de la generación seminal. A tal fin se comparó la variación genética de las semillas provenientes de dos temporadas de cosecha en nueve poblaciones. En todas las poblaciones se detectaron diferencias significativas entre años tanto cuali (presencia/ausencia de alelos raros) como cuantitativas (frecuencias alélicas). Por último, se analizó el polimorfismo en secuencias no codificantes del ADN de cloroplasto. En general se desconoce la función de estas regiones de ADN por lo que se considera que las mutaciones se acumulan en forma selectivamente neutra. La elevada conservación del genoma cloroplástico y la herencia clonal permiten que las variantes haplotípicas se mantengan en un linaje a través de las generaciones. La baja tasa de mutaciones de este genoma, la herencia materna y la escasa dispersión de las semillas en Raulí facilitan la diferenciación entre poblaciones y el seguimiento de los caminos migratorios recorridos por las distintas poblaciones de la especie luego de las glaciaciones del Cuaternario. Mediante las técnicas de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) y RFLP (Polimorfismo en el Largo de los Fragmentos de Restricción) se detectaron dos regiones variables en el genoma cloroplástico de Raulí. El polimorfismo permitió la identificación de dos haplotipos distintos con una clara distribución geográfica en sentido norte-sur. La misma distribución se observó en dos poblaciones de Chile cercanas a la Cordillera de los Andes. Una población de la Cordillera de Nahuelbuta, en la zona costera de Chile presentó el mismo haplotipo que las poblaciones situadas al sur. La variación detectada en los tres niveles analizados es considerablemente alta dada la reducida distribución de la especie en Argentina. La diferenciación genética entre poblaciones en sentido latitudinal observada tanto en el genoma cloroplástico como en el peso de las semillas confirma, en parte, la hipótesis principal de la tesis. Sin embargo, los altos niveles de variación encontrados con los marcadores isoenzimáticos entre poblaciones pertenecientes a una misma cuenca lacustre, agregan el componente longitudinal en el patrón de distribución de la variación genética. A su vez, el proceso de hibridación introduce otro factor de variación por la posible introgresión del pool génico de N. obliqua en N. nervosa. La identificación de dos haplotipos cloroplásticos sugiere la expansión de las poblaciones a partir de al menos dos refugios glaciarios. Se proponen los posibles centros de dispersión luego de las glaciaciones así como un modelo de migración a partir de los mismos. Se discute la importancia de los resultados obtenidos como apoyo a los programas de conservación y utilización de los recursos genéticos de Nothofagus nervosa, así como los distintos procesos evolutivos que ejercen mayor influencia en la variación genética de la especie.Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. et Mil. is an ecologically and economically important species of the southern South American temperate forests. In Argentina it has a very reduced and fragmented natural distribution area. It covers a narrow fringe of 40 km in its maximum wide between 39º 25´ S and 40º 35´ S, following the valleys of the numerous lake watersheds. Overexploitation, overgrazing and recurrent forest fires had seriously affected this species in the past, and led to the implementation of conservation and breeding programs. Knowledge of the amount and distribution of the genetic variation is the first step in such programs. The main objective of this thesis is to contribute with the study of the amount and distribution patterns of the genetic variation in N. nervosa and to relate this variation with evolutive processes like gene flow, hybridisation and the effect of last glaciations by drastic reduction of the forests. The particular distribution of the species restricted to the valleys of the west-east lake watersheds, and the strong unidirectional winds within them, suggest the possibility of a latitudinal genetic differentiation among populations with an extensive gene flow that homogenise the genetic variation within watersheds. Seeds from 28 populations distributed along the entire natural distribution area in Argentina were collected during four consecutive years. For comparison purposes, seeds from three populations from Chile were also harvested. Seed traits as total seed production, 1000-seed weight and damage by insects were analysed in all populations and years. Variation in these traits has a strong environmental influence; therefore adaptive processes could be inferred. All the analysed seed traits were highly variable both among populations (spatial variation) and among years (temporal variation). A strong populations x years interaction exists both for seed weight and seed damage by insects. Besides, significant correlation’s with geographic variables such as latitude and longitude were observed. Seed weight showed a latitudinal variation being the northern most seeds the most heaviest. Genetic variation was analysed through both isozyme and molecular gene markers. Allozyme variants are usually assumed as selectively neutral, although exceptions were described. In that case, variation in these genetic traits could have an adaptive significance. Before using the phenotypic variants as gene markers, genetic analyses was performed in order to be sure of the complete genetic control of the observed variation. For this purpose, buds of 55 individual trees and their offspring from open pollination were collected. Different enzyme systems were assayed founding good resolution and polymorphism in six of them. After a first screening of maternal tissue, 100 seeds from each of those probable heterozygous trees for each putative locus were analysed. Mendelian segregation of the detected variants was tested and eight marker loci were determined. Overlapping between different activity zones in zymograms of one enzyme system (MDH), existence of double or tripled banded phenotypes for homozygous genotypes and natural hybridisation with N. obliqua highlight the importance of the genetic analyses of the observed phenotypic variants and the correct determination of the gene markers. Genetic variation within and among 20 populations of N. nervosa from Argentina and three from Chile was studied using the eight marker loci previously determined. A minimum of 100 seeds were analysed in each population. In addition, bud tissue from 390 adult trees of both Nothofagus nervosa and N. obliqua was assayed: 100 of each species from pure populations, 100 of N. obliqua and 90 of N. nervosa from the sympatric distribution area. These analyses revealed the existence of species-specific alleles in two enzyme loci (Adh and Pgi), allowing the study of the hybridisation process between these two species. High levels of intrapopulation variation were detected with a mean number of alleles per locus (AL) of 3,38; genic diversity () of 1,29; observed and expected heterozygosity (Ho and He respectively) of 15,9 % and 18,1%. Genetic differentiation of each population from the remaining (Dj) varied between 2,4 % and 8,1 %, being the mean genetic differentiation among populations value (), 4,7 %. All these parameters were highly variable both among populations and within watersheds. The most variable populations were those situated to the west, while the higher proportion of hybrid seeds were found among the eastern most populations. Moreover, backcrosses between the F1 generation and the parental species were detected. Comparison with the three Chilean populations revealed higher levels of diversity and differentiation among the Argentinean populations. Temporal variation in the matting system and its influence in the genetic structure of the seeds was also analysed. Comparison between seeds from two harvested years in nine populations showed significant differences in the presence/absence of rare alleles as well as in the frequency of the common ones. Finally, non coding regions of chloroplast DNA were screened searching for polymorphism. The variation in these regions is assumed to be selectively neutral and its function is unknown. However, the high conservation of the chloroplast genome and its clonal inheritance, allows that haplotype lineage’s persist over generations. The slow mutation rate, the maternal inheritance and the scarce seed dispersal in N. nervosa facilitate the genetic differentiation among populations. This differentiation can be used to trace post-glacial migratory routs of the species. Polymerase Chain Reaction (PCR) and Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) were used to look for polymorphism in 16 non coding regions. Two of these regions revealed variation and allowed the identification of two different haplotypes. Moreover these haplotypes had a clear geographic distribution separating populations to the north from those to the south. Same results were obtained in two Chilean populations located near the Andes. The population from Cordillera de Nahuelbuta, in the northern coastal distribution of the species in Chile showed the south haplotype. The variation revealed by the three levels analysed in this thesis (seed traits, isozymes and cpDNA) could be considered as high regarding the very reduced distribution area of the species. The genetic differentiation among populations detected by cpDNA as well as the latitudinal variation in seed weight partially supports the main hypothesis of this work. However, the high differentiation levels observed among populations from the same watershed suggest an even more complex distribution pattern of the genetic variation, with longitudinal and latitudinal components. Moreover, the hybridisation process introduces another source of variation with the possible introgression of the gene pool of Nothofagus obliqua into N. nervosa. The identification of two haplotypes suggest the persistence of the species in at least two different refugia during the last glaciations. The location of such refugia is proposed as well as a model of post-glacial migration. Results are discussed in connection with conservation and breeding programs, and the main evolutive processes affecting the distribution of the genetic variation are stated.EEA BarilocheFil: Marchelli, Paula. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Estación Experimental Agropecuaria Bariloche; ArgentinaFil: Marchelli, Paula. Universidad Nacional de Comahue. Centro Regional Universitario Bariloche; ArgentinaFil: Marchelli, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin