Comparação das técnicas de PCR-RFLP e sequenciamento de região ITS-rDNA para análise filogenética de isolados de Colletotrichum spp.

The genus Colletotrichum is one of the most important pathogenic fungi group, mainly in tropical and subtropical areas of the world. The identification of Colletotrichum species is difficult due to their large morphological variation. Molecular methods, such as PCR-RFLP and rDNA sequence, have been very useful for phylogenic studies of this pathogen. The objective of this work was to compare the PCRRFLP and rDNA sequence techniques for phylogenetic analysis of Colletotrichum spp. Isolates. All isolates were cultivated from cultures grown on Potato Sucrose Broth (PSB), for one week at 24oC. The amplification of the rDNA was accomplished by the ITS1 and ITS4 initiators, followed by digestion of the ITS area using restriction enzymes (Rsa I, Alu I, Hinf I, Hpa II, Hha I, Xho I, Acc I, Eco RI and Taq I). The revelation was made in agarose gel 2%. The primers produced fragments from 600 to 90 pb. The amplified fragment was purified with the kit QIAquick Gel Extraction Kit 250 (Unisciense of Brazil) and the internal transcribed spacer region of the rDNA (ITS1-ITS2) was sequenced. The ITS1- 5.8S-ITS2 sequences were aligned with the software ClustalW and the phylogenetic tree was constructed using the software Mega 3.1. The products obtained with the amplification of the ITS-rDNA produced a fragment of approximately 600 pb, for all the isolated analyzed. The PCR-RFLP technique is not very efficient to separate Colletotrichum spp because some of the restriction enzymes acted in conserved regions of the rDNA, affecting the results. However, the sequencing technique was accurate to separate Colletotrichum isolates per species and hosts, allowing the inclusion of published GenBank sequences. The PCR-RFLP technique should be used together with the rDNA sequencing technique in order to get cheaper and more reliable results in the phylogenic studies of microorganisms.O gênero Colletotrichum é dos grupos fitopatogênicos mais importantes, principalmente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. A identificação das suas espécies é difícil, devido à grande variação morfológica intraespecífica. Métodos moleculares, como PCR-RFLP e o sequenciamento, têm ganhado destaque em estudos de filogenia deste fitopatógeno. Este trabalho objetivou comparar as técnicas de PCR-RFLP e sequenciamento para análise filogenética entre isolados de Colletotrichum spp. Todos os isolados foram cultivados em meio Batata-Sacarose (BS), por uma semana a 24 oC. Inicialmente foi realizada a amplificação do rDNA, utilizando-se iniciadores ITS1 e ITS4. A seguir foi feita a digestão da região ITS utilizando enzimas de restrição (Rsa I, Alu I, Hinf I, Hpa II, Hha I, Xho I, Acc I, Eco RI e Taq I) e revelação em gel de agarose 2%. Obteve-se uma grande variação com produtos da clivagem, de 500 a 90 pb. Os fragmentos amplificados foram purificados com o kit QIAquick Gel Extraction Kit 250 e as amostras foram sequenciadas na região ITS do rDNA de todos os isolados. As sequências foram alinhadas no software ClustalW e a árvore filogenética foi construída no software Mega 3.1. Os produtos obtidos na amplificação da região ITS1- 5.8S-ITS2 do rDNA, com a utilização do par de iniciadores ITS1 e ITS4, revelaram um fragmento de aproximadamente 600 pb para todos os isolados analisados. A técnica PCR-RFLP não foi muito eficiente para a diferenciação das espécies de Colletotrichum spp, pois algumas das enzimas escolhidas tinham o seu sítio de clivagem em regiões conservadas, sobrepondo e mascarando os resultados. Já a técnica de sequenciamento possibilitou a separação dos isolados por espécies e hospedeiro e permitiu a comparação com os sequenciamentos dos bancos de genes. A técnica de PCR-RFLP deve ser utilizada atrelada à técnica de sequenciamento para se obter uma maior economia e veracidade dos resultados em estudos de filogenia de microorganismos