Natural compounds in attenuating virulence in Listeria monocytogenes

Food safety is a pressing global concern with widespread implications. Contamination of food products is linked to the transmission of over 200 diseases. The World Health Organization (WHO) estimates that 1 in 10 people worldwide falls ill each year from consuming contaminated food. Among the foodborne bacteria, Listeria monocytogenes is a significant pathogen known for its impact on public health and economies. Listeria monocytogenes is commonly found in unpasteurized dairy products and ready-to-eat foods, posing a global food safety concern and potentially causing severe health consequences. Listeria monocytogenes causes listeriosis in humans and animals, a disease with a high rate of hospitalization and mortality. Listeria monocytogenes is challenging to control due to its virulence traits and ability to adapt to antibiotics and adverse conditions encountered during food processing. Researchers are studying alternative methods to reduce the presence of pathogens, with bacteriophages, bacteriocins, and natural compounds, like essential oils being explored. Nonetheless, isolated natural compounds offer a consistent approach compared to essential oils, which can vary in composition. This study investigated the effects of four natural compounds (resveratrol, pcoumaric acid, camphor, and linalool) on inhibiting the virulence factors of Listeria monocytogenes. Sub-inhibitory concentrations of these compounds were examined for their impact on motility, quorum sensing, biofilm formation, toxin production, tolerance to adverse conditions, and antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC). Camphor only inhibited motility, while p-coumaric acid reduced the bacterium’ hemolytic activity and increased susceptibility to low temperatures without NaCl. Resveratrol inhibited quorum sensing and biofilm formation and enhanced the impact of low temperatures and high osmolarity. Linalool emerged as the most promising compound, inhibiting all tested virulence traits, and potentiating the impact of stress conditions on bacterial survival. These findings highlight the potential of natural compounds in inhibiting Listeria monocytogenes virulence factors and their applicability as preservatives in the food industry.A segurança alimentar e a contaminação de alimentos são preocupações da saúde pública por todo o mundo. Segundo a Organização Mundial de Saúde, a contaminação de alimentos por organismos patogénicos está associada a mais de 200 doenças, e é estimado pela mesma organização que 1 em 10 pessoas acabam doentes devido ao consumo de alimentos contaminados. Estes organismos patogénicos afetam facilmente grupos vulneráveis, tais como imunocomprometidos, idosos, grávidas e crianças. Adicionalmente, ao impacto na saúde pública também possuem um impacto na economia nacional dos países, comércio alimentar, turismo e na indústria alimentar. As doenças alimentares são normalmente causadas por diversos organismos, tais como bactérias, vírus, ou parasitas através da ingestão de alimentos contaminados. Entre os agentes patogénicos salienta-se a bactéria Listeria monocytogenes, que pode ser encontrada em diversos alimentos, tais como productos lácteos, vegetais, peixes e alimentos prontos a consumir. L. monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva, anaeróbia facultativa, não formadora de esporos com forma de bacilo e ubíqua, que quando ingerida pode causar listeriose. Esta doença afeta principalmente imnunocomprometidos, pessoas idosas e grávidas e possui uma taxa de mortalidade entre 20 e 30%. Esta doença pode apresentar sintomas ligeiras como dores musculares, náuseas, vómitos e diarreia ou evoluir para uma forma mais grave e sistémica, apresentando sintomas mais severos como febre, confusão perdas de equilíbrio e sépsis, cujo tratamento requer hospitalização e que em casos mais graves pode levar à morte. No caso de infeção de grávidas esta doença está associada a morbilidade fetal e neonatal em cerca de 25% dos casos. Esta situação resulta desta bactéria ter a capacidade de se disseminar através da corrente sanguínea e e de atravessar a barreira placentária e de infetar o feto. O sucesso da bactéria L. monocytogenes está relacionado com a sua capacidade em promover a sua internalização em células hospedeiras e de possuir diversos fatores de virulência que lhe permitem sobreviver a agentes antimicrobianos e proliferar em condições adversas. Esta bactéria apesar da temperatura ideal de crescimento ser entre 30 e os 37 °C possui diversos mecanismos de proteção contra condições adversas que lhe permite proliferar a baixas temperaturas (0,4 a 4°C), altas temperaturas (55°C), altas concentrações sal e baixo pH. Como diversas destas condições podem ser encontradas na indústria alimentar, faz com que esta bactéria represente um risco para estas indústrias. Outros fatores importantes da virulência L. monocytogenes é a sua capacidade de motilidade mediada por flagelo e a formação de biofilmes. Quando a uma temperatura de 30 °C esta bactéria consegue movimentar-se devido ao flagelo, permitindo assim uma melhor procura de nutrientes e colonização de locais para propagação do organismo. Esta motilidade mediada por flagelo também está relaciona com a formação de biofilmes tanto na adesão inicial à superfície como na formação do biofilme. Biofilmes são comunidades de células bacterianas ligadas entre si ou/e a uma superfície e envolvidas por uma matriz autoproduzida de substâncias poliméricas extracelulares. A formação de biofilmes permite uma melhor sobrevivência em superfícies como aço ou vidro, contra condições adversas e a agentes antimicrobianos usados na indústria alimentar. Apesar dos biofilmes protegerem a bactéria dos agentes antimicrobianos, esta bactéria também possui mecanismos como bombas de efluxo que lhe confere resistência a agentes antimicrobianos e a antibióticos. Devido à bactéria L. monocytogenes conseguir sobreviver a agentes antimicrobianos e proliferar em diversas condições adversas, novas alternativas têm vindo a ser estudadas com o objetivo de reduzir a presença deste organismo patogénico, tais como a utilização de bacteriófagos, bacteriocinas e compostos naturais, como os óleos essenciais. Focando nos compostos naturais, os óleos essenciais extraídos de plantas já revelaram ter capacidade bactericida contra organismos patogénicos e apresentam a vantagem de ser também uma alternativa a agentes sintéticos ou químicos. Porém estes óleos essenciais são compostos por uma mistura de 20 a 60 diferentes compostos naturais que variam facilmente em termos de constituição. Esta variação na constituição dos óleos essenciais não permite um efeito consistente, e com base neste problema surgiu o estudo de compostos naturais isolados. Os compostos naturais isolados ao contrário dos óleos essenciais não possuem o problema de variação na sua composição. Outra vantagem é que podem ser combinados com outras substâncias como antibióticos para aumentar ou restaurar o seu efeito. Diversos compostos naturais isolados já têm vindo a ser estudados e vários apresentam propriedades bactericidas e anti virulência contra diversos organismos patogénicos. Apesar de, em L. monocytogenes, já existirem alguns estudos com compostos naturais isolados, existem, no entanto, diversos compostos cuja ação é desconhecida nesta bactéria ou que requerem mais estudos na sua virulência. Com base nisto foram selecionados quatro compostos (resveratrol, ácido p - cumárico, cânfora e linalool) para analisar o seu impacto na virulência desta bactéria. Para entender o efeito destes compostos selecionados na virulência de L. monocytogenes foi determinada a concentração mínima inibitória de cada composto. Posteriormente concentrações sub-inibitórias foram também determinadas de forma a ter certeza que o efeito inibitório dos compostos nos ensaios seguintes era devido a um efeito do composto e não devido a morte celular. De seguida procedeu-se ao estudo do efeito dos compostos em diversos fatores de virulência da bactéria tais como “quorum sensing“, biofilmes, motilidade, capacidade hemolítica e tolerância a condições adversas. Primeiramente foi estudado o efeito dos compostos selecionados no “quorum sensing” devido a associação deste com a comunicação celular e outros fatores de virulência como motilidade e formação de biofilmes. De forma a avaliar este efeito foi usado Chromobacterium violaceum como biossensor. Esta bactéria produz violaceína, no entanto, quando o “quorum sensing” é inibida a produção de violaceína também é afetada. Assim dos compostos testados só o resveratrol e o linalool inibiram de forma significativa a produção de violaceína. De seguida, devido a ligação existente entre o “quorum sensing” e a formação de biofilmes e motilidade foram analisados os efeitos dos compostos em estudo nestes fatores de virulência. A motilidade mediada por flagelo da L. monocytogenes é um importante fator de virulência, que lhe permite procurar por nutrientes e melhores locais de proliferação. De forma a avaliar o efeito dos compostos em estudo na motilidade foram usadas placas de TSA com 0,3% (m/v) de agar e compostos naturais. No final do ensaio todos os compostos, expeto resveratrol, mostraram alguma inibição na motilidade deste organismo ao longo das 72 horas de incubação a 30°C. A etapa seguinte deste trabalho consistiu no estudo do efeito destes compostos naturais na formação de biofilmes. A formação de biofilmes permite à bactéria sobreviver a diversas condições e agentes antimicrobianos e proliferar em superfícies como aço ou vidro. Para estudar a capacidade de formação de biofilmes foi usada a metodologia de coloração com violeta de cristal usando placas de 48 poços. Entre os compostos estudados, o resveratrol e o linalool mostraram uma inibição significativa na formação de biofilmes, sendo o efeito do linalool mais acentuado. Outro importante fator de virulência de L. monocytogenes está relacionado com a sua capacidade de infeção de células hospedeiras. Durante este processo esta bactéria precisa de escapar de um vacúolo formado durante o processo de internalização. Para isso a bactéria secreta toxinas capazes de formar poros na membrana do vacúolo. Umas das toxinas é a Listeriolisina O, que é uma citolisina fundamental para o processo de infeção deste organismo. Uma forma de estudar a presença desta toxina é através de um ensaio de hemólise, que quando estudado em in vitro esta citolisina é a capacidade de provocar a hemólise de eritrócitos. Analisando assim a hemólise que ocorre em eritrócitos quando em conjunto com L. monocytogenes após uma exposição aos compostos naturais é possível determinar se os compostos têm algum efeito nestas propriedades desta bactéria. Em primeiro lugar foi realizado um estudo de citotoxicidade dos compostos em relação aos eritrócitos humanos utilizados. Através deste estudo foi possível concluir que as concentrações sub-inibitórias dos compostos não apresentam efeito citotóxico para com os eritrócitos humanos, porém em algumas das concentrações superiores já apresentam efeito citotóxico. Relativamente ao ensaio que permite analisar o efeito na capacidade hemolítica deste organismo após a pré-exposição aos compostos naturais foi possível que certos compostos como o ácido p-cumárico e o linalool foram capazes de inibir a hemólise, sendo que no caso do linalool foi possível inibir totalmente a hemólise provocada por esta bactéria. Após o estudo da influência dos compostos naturais na virulência de diversos fatores de virulência da L. monocytogenes foi analisado se haveria algum efeito por parte dos compostos naturais na tolerância a condições adversas de L. monocytogenes. A capacidade desta bactéria de sobreviver a diversas condições tais como baixas e altas temperaturas, altas concentrações sal e pH ácido faz com que este organismo seja de difícil erradicação. De forma a estudar se os compostos naturais poderiam aumentar a suscetibilidade deste organismo às condições adversas mencionadas, foram misturados compostos naturais juntamente com a bactéria em TSB com cada condição adversa. No caso das concentrações de sal foram incubadas em TSB com 12% (m/v) de NaCl, para o de pH baixo o TSB foi acidificado até um pH de 2.4, no caso de temperaturas elevadas foi utilizado uma temperatura de 55°C e no caso temperaturas baixas uma temperatura de 4°C. Relativamente, ao estudo do stress osmótico provocado pelas concentrações salinas, ao pH baixo e ao ensaio com temperaturas elevados somente o linalool foi capaz de aumentar a suscetibilidade de L. monocytogenes a estas concentrações adversas, sendo que os restantes compostos não demonstraram nenhum efeito significativo. No que respeita ao estudo de temperaturas de refrigeração, este organismo foi incubado por 196 dias a uma temperatura de 4°C com compostos naturais. Os compostos e o organismo patogénico foram também incubados com e sem 12%(m/v) de NaCl. Neste estudo foi possível observar que o linalool, uma vez mais foi capaz de aumentar a suscetibilidade da bactéria à temperatura de 4°C com e sem presença de NaCl. Em relação aos restantes compostos, o resveratrol mostrou diminuir a tolerância deste organismo, porém só na presença de NaCl. O ácido p-cumárico por sua vez também conseguiu alterar a tolerância a temperaturas baixas, porém na presença de NaCl este efeito não ocorre. A canfora não mostrou ter efeito algum na tolerância de L. monocytogenes. Por fim, devido às capacidades deste organismo para resistir a antibióticos e ao crescente aumento do aparecimento de resistências a antibióticos foi realizado um estudo para analisar se estes compostos naturais poderiam ter um efeito modulatório da concentração mínima inibitória dos antibióticos, potenciando assim o seu efeito. Para isso, os compostos naturais foram incubados com o organismo patogénico e 6 antibióticos separadamente (ampicilina, cefotaxima, gentamicina, eritromicina, tetraciclina e rifampicina). Entre os antibióticos testados só para a gentamicina ocorreram alterações da concentração mínima inibitória quando em contacto com resveratrol e linalool. Em suma, os compostos naturais testados neste trabalho foram capazes de inibir ou afetar diversos fatores de virulência de L. monocytogenes. No entanto, o linalool, devido a mostrar efeito em todos os ensaios e estudos realizados, foi, entre os compostos estudados, o composto mais promissor contra L. monocytogenes