Development of new Catechol-Omethyltransferase inhibitors

The Catechol-O-methyltransferase (COMT, EC 2.2.1.6) is an enzyme responsible for the Omethylation of catechol substrates, such as catecholamines and catechol estrogens. Considering its physiological functions and the existence of polymorphisms, several studies associate COMT with the pathogenesis of several neurological disorders, especially with Parkinson’s Disease (PD) as well as with cardiovascular and hormone-dependent cancers, like breast cancers. Given the important role that COMT has in the catecholamines and catechol estrogens metabolism, COMT has become a relevant therapeutic target. Currently, the most effective and clinically approved by the Federal Drug Administration and the European Medicines Agency for the PD therapy consists of the use of Levodopa, combined with COMT inhibitors. Since the commercially available inhibitors for this enzyme still display a lot of disadvantages, like hepatoxicity, difficulty to reach the brain, among others, the main goal of this work was to develop new COMT inhibitors with potential clinical interest for the PD therapy. For this, triazolopyrimidinics were prepared through the Biginelli reaction, that can be considered catechol bioisosteres, therefore have a higher potential to interact with COMT. This hypothesis was confirmed through molecular docking, being predicted similar interactions as the ones that the catecholic substrates forms with the COMT active site. Their inhibitory properties were evaluated in human recombinant COMT lysates, after the compounds’ incubation at 10 and 100 µM. Contrary to what was expected, the compounds increased the enzyme specific activity, being considered COMT stabilizers. The compounds cytotoxicity was also evaluated in neural dopaminergic rat cells (N27), in the same concentrations. The vast majority of compounds at 10 µM did not exhibited cytotoxicity, being observed similar values to those of the commercial COMT inhibitors, Entacapone and Tolcapone, in the studied cell line. As expected, with the increase in compounds’ concentration (100 µM) a decrease in the relative cell proliferation was observed, reaching values considered to be cytotoxic. Altogether, the synthesized compounds at the concentration of 10 µM stabilized COMT and did not induce cytotoxicity in the N27 cells. In sum, these compounds may be useful for thermal stability assays, crystallography, structure-activity relationship studies and display potential to be studied in specific breast cancers cell lines.A Catecol-O-metiltransferase (COMT, EC 2.2.1.6)) é a enzima responsável pela O-metilação de substratos catecólicos, como as catecolaminas e os estrogénios com estrutura catecólica. Considerando as suas funções fisiológicas e a existência de polimorfismos, vários estudos associam a COMT com a patogénese de várias desordens neurológicas, especialmente com a Doença de Parkinson (DP) e também com doenças cardiovasculares e cancros hormonodependentes, como cancros da mama. Devido à importância que a COMT tem no metabolismo das catecolaminas e dos estrogénios catecólicos, a COMT tornou-se nas últimas décadas num importante alvo terapêutico. Atualmente, a terapia mais eficaz e clinicamente aprovadas pela Federal Drug Administration e European Medicines Agency para a doença de Parkinson consiste no uso de Levodopa, combinada com inibidores da COMT. Uma vez que os inibidores desta enzima comercialmente disponíveis ainda apresentam diversas desvantagens, como hepatotoxicidade, dificuldade em alcançar o cérebro, entre outras, o objetivo principal deste trabalho foi desenvolver novos inibidores da COMT com potencial clínico para a terapia da DP. Para isto, foram preparados triazolopirimidínicos através da reação de Biginelli, os quais podem ser considerados bioisósteros de catecóis, podendo por isso ter potencial para interagir com a COMT. Esta hipótese foi confirmada através de docking molecular, prevendo-se interações moleculares semelhantes às dos substratos catecóis com o centro ativo da COMT. As suas propriedades inibitórias foram avaliadas em lisados recombinantes da enzima, após incubação dos compostos nas concentrações de 10 e 100 µM. Contrariamente ao expectável, os compostos aumentaram a atividade específica da enzima, podendo ser considerados estabilizadores da COMT. Foi ainda avaliada a citoxicidade dos mesmos em células dopaminérgicas neuronais de rato (N27) nas mesmas concentrações. A grande maioria dos compostos a 10 µM não mostrou citotoxicidade, observando-se valores semelhantes aos dos inibidores comerciais da COMT, Entacapone e Tolcapone, na linha celular N27. Como esperado com o aumento da concentração (100 µM) ocorreu um decréscimo na proliferação celular, atingindo valores já considerados citotóxicos. No geral, os compostos sintetizados, na concentração de 10 µM estabilizaram a COMT e não induziram citoxicidade nas células N27. Em suma, as moléculas sintetizadas podem ser úteis para estudos de estabilidade térmica, de cristalografia, de relação estrutura-atividade e apresentam potencialidade para ser estudados em linhas celulares especificas do cancro da mama