Discriminazione iperspettrale di infezioni da colpo di fuoco batterico in melo e pero, e caratterizzazione molecolare di alcuni isolati dell'area mediterranea del suo agente eziologico Erwinia amylovora

Dottorato di ricerca in Protezione delle pianteFire blight, caused by the phytopathogenic enterobacterium Erwinia amylovora, is a serious disease of mainly apple and pear, and more than 200 commercially, ornamentally, and ecologically important rosaceous plant species grown in Italy and in other regions in the world. The lack of commercially effective control compounds, other than antibiotics which became prohibited almost worldwide, and the fast spread of fire blight make the disease prevention extremely important. Currently, the best fire blight management strategy is a combination of strict quarantine measurements, sanitation, cultural practices, chemical and biological sprays, and most importantly the vigilant regular monitoring. However, large-scale monitoring is difficult due to the huge number of trees to be inspected. E. amylovora is a genetically monomorphic pathogen, though its different stains have different pathogenicity, severity, and antibiotic resistance. Studying the genetic diversity of E. amylovora is therefore extremely important to track the infection sources, map the distribution of the severe strains, study the evolutionary, and improve resistant varieties against this quarantine pest. The first aim in this study was to discriminate between healthy and fire blight-infected apple and pear plants using their hyperspectral reflectance, and to develop classification models capable of detecting the infection even in the asymptomatic plants. Multivariate analysis showed that hyperspectral data can effectively discriminate between healthy and infected (symptomatic and asymptomatic) apple and pear. Two classification models, Partial Least Squares-Discriminant Analysis (PLS-DA) and Artificial Neural Networks (ANNs), were developed in this study. These non-parametric models successfully classified the studied plants into healthy and fire blight-infected with high accuracy not only in the glasshouse but also in the open field. The second aim in this dissertation was to genotype different strains of E. amylovora, collected from apple and pear in different regions mainly Mediterranean, using an updated set of polymorphic Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) loci. Three new polymorphic loci were identified in the current study and added to other six loci, defined previously, to establish a set of nine VNTR loci to be used in a Multiple-Locus VNTR Analysis (MLVA). The improved MLVA approach recognized 38 haplotypes and seven Clonal Complexes from the studied strains, and demonstrated the high genetic diversity among the Mediterranean strains and among the Italian strains in particular suggesting the multiple introduction events of the disease.Il colpo di fuoco, causato dall’enterobatterio fitopatogeno Erwinia amylovora, è una seria malattia principalmente di pero e melo, e di più di 200 specie di piante rosacee importanti dal punto di vista commerciale, ornamentale, ed ecologico, che crescono in Italia ed in altre regioni nel mondo. La mancanza sul mercato di formulati di controllo efficaci, diversi dagli antibiotici che sono diventati proibiti quasi in tutto il mondo, e la veloce diffusione del colpo di fuoco rende la prevenzione della malattia estremamente importante. Attualmente, la miglior strategia di gestione del colpo di fuoco è una combinazione di severe misure di quarantena, sanitizzazione, pratiche colturali, spray chimici e biologici, e maggiormente importante il regolare monitoraggio. Tuttavia, un monitoraggio su larga scala è difficile a causa dell’enorme numero di alberi da ispezionare. E. amylovora è un patogeno geneticamente monomorfico, sebbene differenti ceppi mostrino differente patogenicità, severità e resistenza agli antibiotici. Studiare la diversità genetica di E. amylovora è quindi estremamente importante per tracciare i punti di origine dell’infezione, mappare la distribuzione di ceppi dannosi, studiare l’evoluzione e migliorare le varietà resistenti verso questo patogeno da quarantena. Il primo obiettivo in questo studio è stato quello di discriminare piante di melo e pero fra sane e colpite da colpo di fuoco utilizzando la loro riflettanza iperspettrale, e sviluppare modelli di classificazione capaci di rilevare l’infezione anche in piante asintomatiche. L’analisi multivariata ha mostrato che i dati iperspettrali possono effettivamente discriminare tra meli e peri sani ed infetti (sintomatici ed asintomatici). Due modelli di classificazione, Partial Least Squares-Discriminant Analysis (PLS-DA) e Artificial Neural Networks (ANNs), sono stati sviluppati in questo studio. Questi modelli non parametrici hanno classificato con successo le piante studiate in sane e colpite da fuoco batterico con elevata accuratezza non soltanto in serra ma anche in pieno campo. Il secondo obiettivo in questa tesi è stato di genotipizzare differenti ceppi di E. amylovora, isolate d melo e pero in diverse regioni principalmente Mediterranee, utilizzando un set aggiornato di loci Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) polimorfiche. Tre nuovi loci polimorfici sono stati identificati nel presente studio ed aggiunti ad altri sei loci, precedentemente definiti, per stabilire un insieme di nove loci VNTR da usare in una Multiple-Locus VNTR Analysis (MLVA). Il migliorato approccio MLVA ha riconosciuto 38 aplotipi e sette complessi clonali per i ceppi studiati, ed ha dimostrato l’elevata diversità genetica tra gli isolati Mediterranei e quelli Italiani che in particolare suggeriscono eventi multipli di introduzione della malattia