Role of ATR and ATM chinasis in telomers omeostasis

Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimicaI telomeri sono essenziali per fornire una struttura protettiva ”cap telomerico”, che difenda le estremità dei cromosomi lineari eucariotici. Se il “cap telomerico” viene perso i telomeri non possono più essere distinti dalle rotture a doppio filamento del DNA (DNA double-stranded breaks, DSBs). Evento che porta all’arresto del ciclo cellulare, fusioni telomeriche, e rapida degradazione delle estremità. Questa protezione è prevalentemente operata dal complesso proteico che lega specificamente il DNA telomerico (Shelterin). Recentemente è stato dimostrato come la mancanza di TRF1 porti i telomeri a somigliare a dei comuni siti fragili durante la replicazione del DNA. Ad ogni modo tutto il complesso shelterin è direttamente coinvolto nella protezione dei telomeri da eventi di fusione, ricombinazione e degradazione nucleolitica. Le protein-chinasi ATM e ATR giocano un ruolo centrale nel rilevare i danni al DNA ed innescare la risposta al danno. Entrambe risultano avere dei ruoli fondamentali nel mantenimento dei telomeri. Infatti nel modello murino in cui è indotta una perdita di funzione di ATM presentano invechiamento prematuro, indicante una inadeguata preservazione dei telomeri (Wong K.K., 2003). In uno studio condotto durante il ciclo cellulare è stata evidenziata l’importanza cruciale di ATM durante la fase G2 nel reclutare MRE11 e NBS1 (Verdun R.E. et al., 2005). Questi esperimenti suggeriscono che l’attivazione dei pathway del riparo del DNA, o di una parte di essi, non sia limitato ai telomeri con disfunzioni o particolarmente corti ma che sia una prassi generale e fondamentale per l’omeostasi telomerica. Nell’intento di indagare la funzione delle protein kinasi ATR e ATM in ambito telomerico si è proceduto ad inibire farmacologicamente Chk1, il principale effettore della risposta mediata da ATR, attraverso UCN-01 e ATM tramite KU55933. Questi due inibitori sono stati somministrati in 2 linee cellulari: Hela e Fibroblasti umani. I trattamenti sono stati eseguiti per 24h combinando anche il trattamento con Fluorodesossiuridina (FdU) un analogo delle basi azotate che provoca un rallentamento della forca replicativa. Analizzando i dati ottenuti con la PNA-FISH riscontriamo che l’inibizione farmacologica di ATM e di Chk1 non comporta l’aumento delle fusioni telomeriche. Visti gli inaspettati risultati ottenuti abbiamo voluto indagare se ci fossero differenze qualitative negli eventi di fusione. Per determinare l’importanza delle vie ATR e ATM –dipendenti in entrambe le tipologie di intermedi telomerici, abbiamo usato la Chromosome-orientation fluorescence in situ hybridization (CO-FISH). Non riscontriamo differenze sostanziali e significative tra il controllo e i trattamenti con i diversi inibitori. Per completare e confermare i risultati totalmente inaspettati dell’analisi citologica siamo andati ad indagare se il 3’overhang fosse stato alterato attraverso una tecnica sviluppata nel nostro laboratorio il T-OLA. Anche dopo l’inibizione di Chk1 o di ATM non abbiamo riscontrato perturbazioni nella lunghezza del 3’overhang. L’inibizione di Chk1 e di ATM nel nostro modello non sembra portare alla perturbazione della struttura protettiva del telomero. In alternativa ritroviamo che i nostri trattamenti sortiscono tutt’altro genere di effetti sui telomeri. Infatti riscontriamo un sostanziale aumento dei segnali telomerici multipli nelle Hela. Inoltre dimostriamo come i nostri inibitori portino all’aumento, dopo un singolo ciclo cellulare, di delezioni telomeriche sia sul singolo cromatide (sister chromatid loss) che su entrambi (telomere deletion). L’effetto è maggiormente pronunciato nei Fibroblasti. Anche se in letteratura non vengono associati tali eventi alla fragilità del telomero, in realtà tale comportamento, la rottura a seguito di stress replicativo, è tipica dei siti fragili. Siamo quindi andati a monitorare un sito fragile inducibile, somministrando i nostri trattamenti farmacologici, per cercare di comprendere meglio i risultati ottenuti. I risultati ottenuti con una linea linfoblastoide che porta la premutazione del sito FRAXA sono in parte sovrapponibili ai risultati ottenuti sui telomeri. Specialmente nelle Hela. Una possibile spiegazione di questa divergenza tra quanto osservato nei fibroblasti da una parte, e nelle Hela e 32B dall’altra, possa essere imputabile alla mancanza di una telomerasi attiva nei fibroblasti. L’interazione tra macchinario del riparo del DNA e telomeri è sempre più oggetto di attenzioni. Di notevole interesse è la comprensione del meccanismo che, come evidenziato anche dai nostri dati, porta proteine quali ATR e ATM a cambiare i target della propria azione. Infatti se è ormai evidente che ciò accada è pressoché sconosciuto il come avvenga e quali proteine medino tale cambiamento.Telomere integrity is essential to maintain chromosome stability and to avoid chromosome end fusion. Telomeres comprise tandem DNA repeats bound by a multiprotein complex known as shelterin. Sheltering contributes to maintenance of telomere integrity and prevents activation of DNA damage response (DDR) at telomeres. In particular it has been shown that TRF1 is important to prevent telomere breakage following replication fork stalling at telomeres. More recently, combined deletion of all the shelterin components revealed that this complex act to protect telomeres from a number of DNA-rearranging process including homologous recombination, NHEJ, ATM/ATR signaling and DNA resection. It has been shown that short dysfunctional telomeres activate DDRs mediated by ATM and ATR checkpoint kinases, which play a crucial role in the cellular response to DNA lesion. Paradoxically, ATR and ATM were found associated to telomeres in a cell cycle manner and in the absence of DNA damage, suggesting a role in the maintenance of telomere homeostasis. Indeed mice in which it was induced ATM loss of function show premature aging and have shorter telomeres than normal cells (Wong K.K., 2003). However, later studies failed to reveal a role of ATM in the elongation of short telomeres by telomerase (wong et al., 2003; Feldser et al 2006). More recently, it was demonstrated that severe reduction of ATR levels in primary murine fibroblasts, does not impair telomere length but induce the appearance of a number of futures typical of fragile sites. Similar finding was reported in murine cells lacking ATM (Qi et al 2003; wong et al., 2003). Collectively these results suggest that ATM and ATR participate to telomere protection in mammalian cells by preventing telomere fragility and recombination. In the effort to better understand the function of ATR and ATM in a telomeric context we respectively inhibited the proteins with UCN-01, an inhibitor of the Chk1 pathway responsive under ATR activation, and KU55933 a direct inhibitor of ATM. We tested this two inhibitor in Hela cells and human fibroblast. Furthermore, to induce a stalled DNA replication fork we added fluorodesossiuridine (FdU) in combination with the inhibitors. Here, we report by using telomere-fluorescence in situ hybridization (Telo-FISH) on metaphase chromosomes that in Hela cells and in human fibroblast both the inhibitors not seems to increase the telomere fusions. Via chromosome orientation-FISH we investigate if there are different involvement of the two protein in the type of chromosome fusions during the replication of leading and lagging strand. No differences are reported. With the Telomeric oligonucleotide ligation assay (T-OLA) we analyze the length of the 3’-overhang, the single strand region at the end of the telomeres. Our results show no difference of 3’-overhang length between control and the inhibitors treatment. Altogether this results seems to indicate that the inhibition by Chk1 and ATM pathway don’t affects the protective structure of telomeres. On the other hands we report a substantial increase of Multiple telomeric signal (MTS) in Hela cells but not in human fibroblast. We also show that the inhibition of Chk1 and ATM, mainly in Human fibroblast, lead to Telomere deletion (TD) and Sister Chromatid loss (SCL). Together these findings leads us to think that in absence of the ATM and ATR signaling telomeres resemble common fragile sites. In the effort to better understand our data we test our inhibitor on a common fragile site: FRAXA. The data from a linfoblastoid line with FRAXA, 32B, partially fit with the telomer’s one. Especially with Hela results. We suppose that the difference between Hela and 32B on one site, and Human Fibroblast on the other may be attributed to the lack of an active telomerase in Fibroblast. The attention for the interaction between DNA Repair Machinery and Telomer are growing in the scientific community. Particularly the mechanism that brings some protein, as ATM or ATR as we show, to remodelling their response in a telomeric context