Study of benthic microbial communities in temporary rivers: effect of hydrological conditions on nutrient flux and fate of organic micropollutants

Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologicheNelle regioni semi-aride del pianeta i fiumi temporanei vanno incontro a ricorrenti periodi di siccità che variano in estensione e durata. Questi ecosistemi, caratterizzati da una elevata instabilità, stanno andando incontro ad una estensione della durata e della frequenza degli eventi estremi in conseguenza del cambiamento climatico. Nonostante i fiumi temporanei rappresentino un importante risorsa idrica per le popolazioni locali, sono stati a lungo ignorati nei piani di monitoraggio perché creduti “biologicamente inattivi” durante il periodo di siccità. Scarse sono ad oggi le informazioni relative a questi ecosistemi. Questa Borsa di Dottorato è stata finanziata dal Progetto Europeo MIRAGE (Mediterranean Intermittent River ManAGEment, FP7-ENV-2007-1,GA 211732, 2009-2011) ed è stata svolta persso il Laboratorio di Ecologia Microbica dell’Istituto di Ricerca Sulle Acque del Consiglio Nazionale delle Ricerche (IRSA-CNR, Roma). L’obiettivo del Progetto MIRAGE è stato quello di acquisire specifiche conoscenze per una migliore valutazione dell’integrità ecologica dei fiumi temporanei dell’area Mediterranea. In particolare questa tesi ha riguardato lo studio degli effetti di condizioni estreme (siccità/piene) sulla struttura e la funzione delle comunità microbiche bentoniche in condizioni naturali e in condizioni di laboratorio, così come le interazioni tra le comunità microbiche e le sostanze pericolose. Le comunità microbiche del sedimento svolgono un ruolo importante nella degradazione della sostanza organica favorendo il trasferimento di energia ai livelli superiori della catena trofica basata sul detrito. Nei fiumi temporanei l’alternarsi di condizioni idrologiche estreme può compromettere il buon funzionamento dei processi di degradazione mediati dalle comunità microbiche e quindi anche il destino degli inquinanti nell’ambiente, con importanti ripercussioni sul funzionamento generale dell’ecosistema. Le proprietà strutturali e funzionali delle comunità microbiche del sedimento del fiume Candelaro (Italia meridionale) in diverse fasi idrologiche sono state caratterizzate in studi di campo, e di laboratorio, attraverso la misura dell’abbondanza batterica (colorazione DAPI, microscopia ad epifluorescenza), della biomassa totale vivente (concentrazione di ATP, luminescenza), la conta delle spore (colorazione e microscopia ottica), la produzione procariotica di carbonio (assorbimento di 3H-leucina), la respirazione (consumo di O2 in camere di incubazione e ETS), attività enzimatiche extracellulari (aminopeptidasi, fosfatasi alcalina, lipasi e beta-glucosidasi, tecnica fluorimetrica), identificazione dei siti positivi per la fosfatasi alcalina (ELF®97-P, microscopia a epifluorescenza). Nell’ambito di questo progetto sono state anche eseguite misure dei parametri fisico-chimici dei sedimenti e della concentrazione di microinquinanti (idrocarburi policiclici aromatici – PAH- e alchilfenoli- NP) inclusi nella lista delle sostanze prioritarie della Comunità Europea approvata dalla Comunità Europea (2008/105/EC). La composizione chimica dei sedimenti ha mostrato un elevato stato trofico caratterizzato da elevati contenuti di nutrienti (TOC e TN), sostanza organica (AFDW), e contaminanti. Diverse condizioni idrologiche, che hanno determinato nel sedimento diversi gradi di umidità dalla saturazione alla siccità, hanno modificato la concentrazione dei microinquinanti. Si è osservata una drastica riduzione della concentrazione di PAH e NP nei sedimenti secchi (8,3±0,4 e 299 ±125 ng g-1 rispettivamente) ed le più elevate concentrazioni in condizioni di portata media (304±56 e 2710±67 ng g-1). Le drastiche variazioni idrologiche hanno anche determinato significativi cambiamenti dell’attività microbica del sedimento con potenziali ripercussioni sul flusso dei nutrienti. Elevate condizioni di portata, osservate nell’estate 2009, hanno determinato le più elevate produzioni procariotiche di C (range 0,24-0,81 μmol C h-1 g-1), mentre i valori più ridotti sono stati osservati durante il periodo di siccità osservato nell’estate 2010 (0,09±0,02 μmol C h-1 g-1). Le portate elevate hanno inoltre stimolato l’attività enzimatica extracellulare su substrati organici fosforilati (fosfatasi alcalina 2,69±0,09 μmol MUF h-1 g-1), e carboniosi (beta-glucosidasi e lipasi, 1,10±0,17 e 1,15±0,23 μmol MUF h-1 g-1 rispettivamente). La comparazione delle attività enzimatiche misurate in aree di sedimento adiacenti a diverso grado di idratazione ha mostrato una riduzione moderata di tutte le attività nel sedimento secco rispetto a quello sommerso, dove comunque l’attività di fosfatasi alcalina svolge un ruolo predominante. Indagini di laboratorio sono state condotte per indagare sulla risposta delle comunità microbiche ai diversi fattori ambientali. Il primo esperimento è stato allestito per descrivere la risposta dei parametri metabolici della comunità microbica alla reidratazione dei sedimenti campionati in un periodo di siccità. Nelle 24 ore successive alla reidratazione è stata osservato un incremento della biomassa e delle attività metaboliche descritte dalla misura della produzione procariotica di C, della respirazione e delle attività enzimatiche extracellulari. L’incremento della produzione procariotica di C è stata correlata all’attività di aminopeptidasi (r=0,78, p<0,05) mentre l’incremento della respirazione è correlabile a quella della concentrazione di ATP (r=0,74, p<0,001). L’abbondanza delle spore è inoltre diminuita significativamente nelle prime due ore quando il livello delle attività metaboliche ha raggiunto i valori più elevati. L’applicazione della tecnica per l’osservazione al microscopio dei siti attivi per l’attività della fosfatasi alcalina (ELF®97P) ha mostrato, nei sedimenti secchi, un numero di siti attivi superiore al numero di cellule. Questo risultato lascia supporre la presenza di enzimi “liberi”, quindi non associati alla parete delle cellule batteriche, in grado di liberare P inorganico anche in condizioni di siccità. Le interazioni tra le comunità microbiche e gli inquinanti organici sono state indagate in microcosmi contenenti acqua di fiume ricostituita (sterile e priva di carbonio organico disciolto) e sedimenti naturali campionati nel fiume Candelaro. Il sedimento naturale (controllo) è stato arricchito con una miscela di PAH in concentrazione 10 (10X) e 100 (100X) volte più elevate di quelle misurate in situ. Durante i 28 giorni dell’esperimento è stata osservata all’interno della miscela di PAH una diminuzione del solo fenantrene, la cui concentrazione è risultata essere inferiore al 50% di quella misurata inizialmente. Una completa degradazione del fenantrene è stata osservata dopo un prolungata incubazione (300 giorni) nel trattamento 10X, durante la quale anche la concentrazione di fluorantene è diminuita significativamente. La presenza della miscela di PAH induce variazioni del metabolismo microbico particolarmente a carico della fosforilazione ossidativa. Un andamento negativo è stato osservato infatti in entrambi i trattamenti tra i valori della respirazione e la concentrazione di ATP (controllo, p > 0,05; 10X, p < 0,05; 100X, p < 0,01). Tuttavia la miscela di PAH ha stimolato significativamente la produzione procariotica di carbonio, indicando il progressivo utilizzo di questi composti. In modo anomalo però, questo incremento non è stato associato ad un incremento delle abbondanze batteriche. In conclusione, i risultati ottenuti da questa indagine hanno contribuito a migliorare le conoscenze dei fiumi temporanei nelle varie fasi idrologiche, mettendo in luce il ruolo funzionale delle comunità microbiche nel flusso del C e degli inquinanti. I risultati di queste indagini possono rappresentare il punto di partenza per includere il compartimento microbico nelle campagne di monitoraggio il cui ruolo nei cicli biogeochimici non sembra trascurabile neanche nei periodi di siccità. Le informazioni ottenute sono fruibili dalle Autorità locali deputate alla gestione della qualità delle risorse idriche.In the semi-arid regions of the planet temporary rivers show a recurrent dry phases of varying duration and spatial extent that determine an elevated degree of instability in these ecosystems. These systems are going to be subjected to an extension of the length and frequency of extreme events as a consequence of the climate change. Despite their importance as water resource, these ecosystems have been ignored because believed “biologically inactive” during the period of drought. Scarce are to date the information on these ecosystems. This PhD grant was funded by the European Project MIRAGE (Mediterranean Intermittent River ManAGEment, FP7-ENV-2007-1,GA 211732, 2009-2011) and was carried out in the Laboratory of Microbial Ecology, at the Water Research Institute - National Research Council (IRSA-CNR, Rome, Italy). The aim of this Project was to provide specific key knowledge for a better assessment of ecological integrity in Mediterranean temporary rivers. In particular this survey has regarded the study of the effects of extreme hydrological conditions (drought/flooding) on the structure and function of benthic bacterial communities both in situ and under laboratory conditions, as well as the interactions between microbial communities and hazardous substances. The benthic microbial communities play a crucial role in the carbon and nutrient fluxes, favouring the energy transfer to the higher levels of the detritus-based food web. In temporary rivers, the contrasting hydrological conditions can affect the correct functioning of the microbial degradation processes and thus the fate of pollutants in the environment, with severe influences on the overall ecosystem functioning. Structural and functional characteristics of microbial benthic communities of the Candelaro river (Southern Italy) were assessed in field studies and in microcosms by measuring bacterial abundance (DAPI staining, epifluorescence microscopy), total living biomass (ATP concentration, luminescence), spore enumeration (optical microscopy after specific staining), bacterial carbon production (3H-leucine uptake), community respiration (O2 consumption in incubation chambers and ETS), extracellular enzymatic activities (aminopeptidase, alkaline phosphatase, lipase and beta-glucosidase, fluorimetric technique), identification of sites with extracellular alkaline phosphatase activity (ELF®97-P, epifluorescence microscopy). In the frame of this Project have been carried out measurements of physicochemical parameters as well as the concentration of micropollutants included in the list of prioritary substances approved by the European Community (2008/105/EC) as polycyclic aromatic hydrocarbons – PAHs- and alkylphenols- NPs). Chemical composition of sediment showed a high trophic gradient characterized by high content of nutrients (TOC e TN), organic matter (AFDW) and contaminants. Different hydrological conditions, that induced changes in sediment moisture from saturation to drought, determined changes in the concentration of micropollutants in the sediments. A drastic reduction of PAHs and NPs concentrations was observed in dry sediments (8.3±0.4 and 299 ±125 ng g-1 respectively) while the highest under medium flow conditions (304±56 and 2710±67 ng g-1). Drastic modifications in hydrological conditions determined significant changes of the benthic microbial activity implying repercussions on the nutrient flux. High flow conditions, in this survey observed in summer 2009, determined the highest prokaryotic C production (range 0.24-0.81 μmol C h-1 g-1), while the lowest rates were observed during an episode of summer (2010) drought (0.09±0.02 μmol C h-1 g-1). Extracellular enzyme activities were also affected by high –low flow conditions. High flow stimulated in the sediment the highest rates on organic phosphorous (alkaline phosphatase activity, max rates 2.69±0.09 μmol MUF h-1 g-1) as well as on carbonaceous substrates (beta-glucosidase and lipase, max rates 1.10±0.17 and 1.15±0.23 μmol MUF h-1 g-1). The comparison of extracellular enzyme activities measured in adjacent areas characterized by a different degree of moisture showed a moderate reduction of all enzyme activities in the dry sediments with respect to that submerged, where overall the alkaline phospatase activity played a main role. Laboratory tests were carried out to investigate the microbial community responses to different environmental factors. The first experiment was performed to test the response of metabolic properties of the microbial community to the rewetting of sediments sampled in a period of drought. In the first 24 hours after rewetting was observed a prompt response of the biomass and metabolic activities described by Procariotic C Production, respiration and extracellular enzyme activities. The increase of the procariotic C production was related to aminopeptidase activity (r=0.78, p<0.05) whereas the increase of the community respiration was related to ATP concentration (r=0.74, p<0.001). The abundance of spores decreased significantly within two hours when the highest level of microbial metabolic activity was approached. The application of the staining technique (ELF®97P) for the microscopic identification of the positive site for alkaline phosphatase activity, showed a number of sites higher than cell abundance even in dry sediments. This result let us infer the presence of “free” enzymes, hence not associated to the bacterial cell wall, capable to release inorganic P even in dry conditions. The interactions between benthic microbial communities and organic pollutants were investigated in microcosms containing reconstituted and sterilized dissolved organic C-free freshwater and natural sediment of Candelaro river. The natural sediment (control) was spiked with a mixture of PAHs in concentration 10 (10X) and 100 (100X) times higher than in situ values. Over the 28 days of the experiment a decrease in PAHs concentration in sediment was only observed for the phenanthrene, whose concentration was below the 50% of the initial conditions. A complete degradation of phenanthrene was then observed after a prolonged incubation (300 days) in the 10X treatment in which also fluoranthene decreased significantly. The presence of the PAH mixture induced variations of the microbial metabolism particularly in the process of oxidative phosphorylation. A significant negative trend was observed in both treatments between respiration rates and ATP concentrations (control, p > 0.05; 10X, p < 0.05; 100X, p < 0.01). Nevertheless, the PAH mixture stimulated significantly the increase of bacterial carbon production meaning a progressive utilization of PAH to produce biomass. Abnormally this process was not associated with the increase of the number of cells. In conclusion, the results obtained during this experimental activity contributed to a better knowledge of temporary rivers and a better understanding of the functional role of bacterial community in the C and micropollutants flux. The results of these investigations can be the starting point to include the microbial compartment in the survey campaigns of temporary rivers, which role in biogeochemical cycles seems not negligible even in drought periods. This information is accessible by the local Authorities who manage the quality of water resources