The kernel texture in relation with the technological characteristics in durum wheat

Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetaliIl frumento duro, tra i diversi cereali, è quello che certamente riveste un ruolo fondamentale nel sistema agroalimentare italiano. Tale ruolo è determinato oltre che dall’insieme dei costituenti nutrizionali, anche dalla versatilità con la quale è possibile utilizzarlo nella produzione di alimenti largamente diffusi e particolarmente graditi dai consumatori. I componenti che influenzano in maniera significativa la qualità della granella sono proteine ed amido, che peraltro rappresentano i principali componenti chimici della cariosside. Tra le proteine merita particolare attenzione una coppia di proteine solubili, le puroindoline, importanti nel determinare la durezza della cariosside. Le puroindoline, due polipeptidi associati alla membrana dei granuli d'amido, sono codificate dai loci Pina-D1e Pinb-D1, localizzati nel braccio corto del cromosoma 5D, e di conseguenza, assenti in grano duro (Triticum turgidum ssp. durum). Per valutare l’influenza delle puroindoline sulla granulometria, diversi studi sono stati condotti su varietà di grano tenero soft e hard, ma soprattutto su linee di grano duro con cariosside a tessitura soft (RILs) ottenute dall’incrocio tra la linea di sostituzione Langdon 5D (5B) contenente il cromosoma 5D del grano tenero Chinese Spring , e la varietà di grano duro “Cappelli mutante” privo del locus Ph1. In particolare sono presentati e discussi i risultati di analisi condotte sulla presenza ed espressione dei geni puroindolinici mediante amplificazione PCR, e sulla presenza e comportamento delle puroindoline mediante elettroforesi monodimensionale A-PAGE ed immunoelettroforesi “Western Blotting” con anticorpi specifici. La struttura dei cromosomi omeologhi 5A e 5B presenti nelle piante contenenti i geni puroindolinici è stata analizzata utilizzando marcatori molecolari SSR (Simple Sequence Repeats o microsatelliti) specifici per le diverse regioni dei suddetti cromosomi. Infine è stata determinata la variazione della tessitura della cariosside nelle linee ricombinanti, la loro composizione in proteine di riserva, ed è stato valutato come alcuni importanti caratteri tecnologici quali durata e consumo energetico della macinazione, resa in farina, granulometria e stato fisico dei granuli d’amido o alcuni parametri alveografici (P,L e W), farinografici (assorbimento, Peak Time, stabilità, caduta) possano essere modulati dalla tessitura della cariosside in genotipi tetraploidi. Dall’attività di ricerca è emerso che, a conferma del legame tra i due prodotti genici, la presenza/assenza delle due puroindoline (Pin a e Pin b) a livello dei granuli d’amido riguarda entrambe le proteine e mai una soltanto I marcatori SSR del cromosoma 5B del parentale Colosseo sono risultati diversi da quelli presenti nei parentali Langdon5D(5B) e Cappelli mutante e sono stati ritrovati nelle plantule F6 derivate dalle famiglie 482 e 504, suggerendo che gran parte del cromosoma 5B di Cappelli mutante è assente in queste plantule, garantendone così la stabilità genetica e la fertilità. Tuttavia questa analisi non ha messo in evidenza la mancanza di nessuno degli SSR specifici per il cromosoma 5B, mancanza associabile ad un evento di ricombinazione allosindetica tra i cromosomi 5DS e 5BS. Le linee F6 omozigoti per la presenza dei geni puroindolinici allevate in parcelle replicate hanno dimostrato che la ridotta sofficità delle loro cariossidi ha un forte impatto su diversi caratteri qualitativi di interesse tecnologico. Ad esempio, la resa in farina di queste linee soft è di oltre il 23% superiore a quella delle loro controparti a tessitura hard. Inoltre la sofficità delle cariossidi determina una forte riduzione della tenacità dell’impasto (P alveografico), del rapporto P/L e dell’assorbimento idrico durante le fasi di impastamento. L’inferiore grado di danneggiamento dell’amido caratteristico delle cariossidi a tessitura soft spiega anche il più elevato indice di stabilità farinografica e la maggiore “mixing tolerance”, entrambe correlate con il ridotto assorbimento idrico. Le linee ricombinanti analizzate in questa tesi, ottenute senza ricorrere alla transgenesi, certamente superiore per efficienza e velocità di applicazione alle tecniche classiche di miglioramento genetico, ma attualmente osteggiata dall’opinione pubblica, forniranno materiale per sviluppare varietà di grano duro da destinare alla produzione di pane e pasta e, inoltre, per le loro caratteristiche di sofficità, consentiranno lo sviluppo di prodotti alimentari fino ad ora esclusivi del grano tenero, come biscotti e fette biscottate.Amongst cereals, durum wheat plays a key role in Italian agrifood system. In addition to nutritional value, this role is determined also by the versatility with which it can be used in food production. The components that significantly influence the quality of the grain are proteins and starch, which also represent the main chemical costituents of the kernel. Among the proteins, a pair of soluble proteins deserves particular attention, the puroindolines, which are claimed to be the principal determinant factor of endosperm texture in common wheat. The puroindolines, associated with the membrane of the starch granules, are encoded by the Pina-D1 and Pinb-D1 loci, located on the short arm of chromosome 5D, and, therefore, are absent in durum wheat (Triticum turgidum ssp. durum). To evaluate the influence of Pina and Pinb on grain size, several studies have been conducted on different cultivars of soft and hard common wheat and on lines of durum wheat with a soft texture (RILs- Recombinant inbred lines) obtained from the crossing between the substitution line Langdon 5D (5B) containing the chromosome 5D of Chinese Spring common wheat and the durum wheat cultivar "Cappelli M” lacking the Ph1 locus on chromosome 5BL. The main aim of this work was the genetic, biochemical and technological characterization of lines of durum wheat (Triticum turgidum ssp durum) containing the alleles Pina-D1a and Pinb-D1a on chromosome 5DS as a result of allosyndetic recombination. The presence or absence of the introduced genes has been demonstrated by the use of molecular marker-assisted selection (MAS). In particular, in this work are discussed the results of analyses conducted on the expression of puroindoline genes by PCR amplification, the behavior of puroindoline proteins bound to starch granules by A-PAGE electrophoresis and immunoblotting with specific antibodies, in tetraploid durum wheat lines. The structure of the homoeologus chromosomes 5A and 5B present in durum wheat lines containing the puroindoline genes was analyzed using molecular markers SSR (Simple Sequence Repeats) specific for the different regions in these chromosomes. Finally was determined the variation in the texture of the kernel in recombinant lines, their composition in storage proteins, and was evaluated a bulk of important technological characteristics such as duration and energy consumption of the milling, flour yield, particle size and physical condition of the starch granules. Some parameters (P, L and W , absorption, peak time, stability, fall) are found to be modulated by the kernel texture in tetraploid genotypes. The SSR markers on chromosome 5B of parental cv Colosseo were different from those in the parental substitution line Langdon5D (5B) and Cappelli M and were found in plantlets F6 derived from families 482 and 504, suggesting that a large part of chromosome 5B of Cappelli M is absent, thereby ensuring that the genetic stability and fertility. However this analysis has highlighted the lack of any specific SSRs for chromosome 5B associated with a lack allosyndetic recombination event between chromosomes 5BS and 5DS. The F6 lines homozygous for the presence of puroindoline genes grown in replicated plots showed that the reduced softness of their kernels have a strong impact on several quality traits of technological interest. For example, the yield of these lines soft flour is over 23% higher than that of their counterparts in hard texture. Furthermore, the softness of the kernels determines a strong reduction of the toughness of the dough (P alveographic) of the P / L ratio and water absorption during the kneading. The lower degree of damage of the starch grains characteristic of a soft texture also explains the higher farinografic stability index and greater "mixing tolerance", both correlated with the reduced water absorption. The recombinant lines analyzed in this thesis, produced by allosyndesis and without by transgenesis, certainly superior in efficiency and speed of application to the classical techniques of genetic improvement, but currently opposed by public opinion, will provide material to develop wheat cultivars for the production of bread and pasta and also for their characteristics of softness, allow the development of food so far exclusive of common wheat, such as biscuits and rusk