Manipolazione genetica della composizione dell'amido

Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetaliIn campo alimentare il frumento riveste un ruolo fondamentale dato che è alla base della dieta di milioni di persone nel mondo, ed è, infatti, utilizzato per la produzione di prodotti alimentari di uso comune come pasta, pane, noodles, cous cous e biscotti. L’amido, che costituisce circa il 70% in peso della cariosside di frumento, è il principale componente della farina e della semola e ne influenza le caratteristiche qualitative e funzionali. Tale componente è costituito da due tipi di polimeri in stretta associazione: amilosio ed amilopectina, che hanno la stessa struttura di base ma differiscono nella lunghezza e nel grado di ramificazione. L’amilosio, che corrisponde circa al 30% dell’amido, è essenzialmente lineare mentre l’amilopectina presenta numerose ramificazioni. Nella sintesi dell’amilosio è coinvolta una sola classe di amido sintasi (GBSSI o waxy), mentre l’amilopectina è sintetizzata dall’azione concertata di diverse classi di amido sintasi, di enzimi di ramificazione (BE) e di enzimi di deramificazione (DBE). Oltre ad essere un componente essenziale di molti alimenti, l’amido riveste un ruolo importante come additivo o materia prima nell’industria tessile, medico-farmaceutica, della carta, della plastica e degli adesivi. Attualmente l’attenzione dei ricercatori si è focalizzata sugli amidi ad alto contenuto di amilosio, in quanto i nutrizionisti ritengono che tali amidi svolgano un ruolo analogo alla fibre alimentari con effetti benefici sulla salute umana, prevenendo e curando molte malattie tra cui il tumore al colon, l’obesità, il diabete di tipo II e l’osteoporosi. Inoltre è stato osservato che semole con elevato contenuto di amilosio producono pasta di qualità superiore mostrando un miglior nervo dopo la cottura. L’amido a basso contenuto in amilosio è utilizzato, soprattutto, per la produzione di prodotti da forno e surgelati, in quanto i prodotti che lo contengono risultano avere maggiore consistenza e conservabilità. In questo lavoro di Tesi vengono descritti approcci per modificare la composizione dell’amido di frumenti duri e teneri attraverso manipolazioni genetiche delle vie biosintetiche. In particolare, un set di mutanti parziali e completi di frumento duro e tenero waxy è stato caratterizzato valutando l’effetto dei singoli geni waxy sulla sintesi dell’amilosio, sulla composizione e struttura dell’amido e sulle caratteristiche qualitative degli impasti. Dalle nostre analisi è risultato che il gene Wx-B1 ha un ruolo predominante nella sintesi di amilosio. Inoltre, nei mutanti parziali waxy di frumento duro sembra esistere un meccanismo di compensazione, con l’assenza di un’isoforma in parte compensata dalla presenza dell’altro enzima. Allo scopo di ottenere linee di frumento duro e tenero con elevato contenuto di amilosio sono state usate diverse strategie. Un primo approccio è consistito nella identificazione ed utilizzazione di mutanti naturali o indotti nei geni che codificano per le amido sintasi SSII (note anche come Sgp-1). Attraverso le analisi TILLING ed uno screening con SDS-PAGE è stato possibile identificare numerose mutazioni nei geni Sgp-1. Una seconda strategia utilizzata ha previsto la produzione di linee di frumento duro che sovraesprimono il gene waxy ed il silenziamento dei geni che codificano per gli enzimi di ramificazione di classe IIa (BEIIa) mediante metodologie di ingegneria genetica. La sovraespressione del gene Wx-B1 non ha prodotto variazioni nel contenuto di amilosio e nelle proprietà chimico-fisiche dell’amido. Il silenziamento dei gene BEIIa è stato effettuato con la tecnica del RNA inteference, trasformando due differenti cultivar di frumento duro (Svevo e Ofanto) con metodo biolistico e agrobatterio.Wheat plays an important role in the food industry where is used for the production of a vast array of foods which are a regular part of human diet, as bread, pasta, noodles, biscuits, rolls, breakfast cereals, cookies and cakes. Starch, which accounts for 65-75% of wheat grain dry weight, is the major constituent of flour and semolina and strongly affects their functionality. Reserve starch is composed of two types of polymers, amylose and amylopectin. Amylose is a linear polymer that constitutes about 30% of total starch, whereas amylopectin has a branched structure and constitutes the remaining starch. A class of starch synthase (Granule Bound Starch Synthase: GBSSI) is involved in amylose synthesis, while the amylopectin is produced by the concerted action of starch synthases (SSI, SSII, SSIII), branching (BEs IIa, BEs IIb and BEs I) and debranching enzymes (DBEs). The possibility to manipulate starch composition in cereals, and in wheat in particular, is receiving an increased attention, due to the recognition of its important role in food and non food applications. Starch can be used as a basic material for the production of non-food products in paper, plastic, adhesive, textile, medical and pharmaceutical industry. At present the researchers are focusing on high amylose starches because derived foods have an increased amount of resistant starch, which has been shown to have beneficial effects on human health. The nutritionists believe that the resistant starch has a role similar to dietary fibre inside the intestine, protecting against diseases as colon cancer, type II diabetes, obesity and osteoporosis. Moreover, pasta produced with semolina containing higher amylose content shows good cooking resistance and firmness, satisfying consumer preferences. Low amylose starches can be used for the production of higher quality noodles and frozen foods, additionally, they have positive impact on food shelf life. In this work different approaches in order to modify starch composition have been undertaken. In particular, a set of partial and complete waxy mutants of durum and bread wheat has been characterized by evaluating the effect of the single waxy genes on amylose synthesis, starch structure, composition and flour qualitative characteristics. Wx-B1 allele has resulted to be the most powerful gene controlling the amylose synthesis; moreover, a compensation mechanism seems to be present in partial waxy durum lines, with the functional waxy gene compensating for the lack of other allele. In order to obtain high amylose lines of bread and durum wheat, different strategies have been used. The first approach has been the identification and utilization of natural or induced mutants in the genes encoding the starch synthases SSII (also known as Sgp-1). Several mutations in Sgp-1 genes have been identified by TILLING and SDS-PAGE analysis on a mutagenized population of bread wheat. The second strategy has consisted in the production of durum wheat lines overexpressing a waxy gene and the silencing of genes encoding branching enzymes of class IIa (BEIIa) using transgenic approaches. The overexpression of Wx-B1 gene doesn’t affect amylose content and starch properties. SBEIIa genes have been silenced by RNA interference in two different durum wheat cultivar (Svevo e Ofanto), using the biolistic and agrobacterium approaches