Physiological and growth responses to cadmium exposure in hydroponic culture of Salicaceae to select clones with phytoremediation ability

Dottorato di ricerca in Ecologia forestaleThe presence of contaminated sites in ever increasing numbers brings several management problems and often leads to a waste of important resources, such as soils and water which cannot be utilised. Remediation with conventional technologies is sometimes unfeasible due to economic reasons or for the opposition of the public opinion, but it is often the only available alternative. Since many years, biological techniques for remediation, bioremediation and phytoremediation, have been studied; they can give acceptable results with a lower environmental impact, even if with longer time periods. In particular, the use of higher plants in decontamination has been limited by legislation constraints, and also for lack of plant species which can be really effective towards specific contaminants. The main objective of this thesis was to enhance the potentials to remediate the environmental contamination through biological systems. It is considered that poplars and willows can contribute to this objective for some reasons: 1) poplars and willows have a fast rate of growth, high biomass productivity, high transpiration rate and grow easily from cuttings; 2) there are experimental evidences of a wide genetic variability between and within species concerning the ability to absorb and immobilize metals inside the plants and their allocation to the various plant organs; 3) exists a wide germplasm availability of both genera that include interspecific hybrids, partially of exotic provenance, and species of the national flora. In this context, the specific objective was to evaluate phytoremediation capability of some poplar and willow clones for cadmium tolerance, accumulation and translocation by a hydroponic screening. Rooted cuttings were exposed for three weeks to 50 μM cadmium sulphate in a growth chamber and physiological parameters and cadmium content distribution among plant parts were evaluated. The results allowed to select some clones that were better able to survive, grow and accumulate cadmium than others. In fact these clones adapted to cadmium presence, by means of growth and eco-physiological changes, such as maintenance of photosynthesis and transpiration, cadmium allocation in roots or original cuttings, developing of protective mechanisms and changing the allocation pattern of biomass. Poplar clones, with similar characteristics of accumulation, distribution and tolerance to cadmium, were classified by means of hierarchical cluster analysis. Moreover, tolerance index (Ti), bio-concentration factor (BCF) and translocation factor (Tf) were analysed to compare the behaviour of poplar and willow clones with regard to cadmium tolerance, accumulation and translocation to aerial parts. On average, poplar clones showed a two times higher capability to remove metal from the solution respect to willow, expressed as total BCF. On the other hand willow clones exhibited a more than double ability to accumulate metal in the aerial parts respect poplar, expressed as Tf. Comparison between the two species for that regards cadmium tolerance was highlighted by the analysis of Ti. On the basis of the dry biomass of total plant, on average of all clones analysed, Ti revealed that willows tolerate cadmium much more than poplars. Finally, the effects of cadmium on poplar and willow clones with different translocation capacity to leaves were examined by imaging chlorophyll fluorescence analysis to characterise the damage produced by metal at leaf level. This technique has been shown to be capable of revealing spatial and temporal changes during plants stress development as well as environmental effects on several aspects of whole plant physiology. For this study poplar and willow clones with an increasing content of cadmium in leaves were used. The results indicated that willow clone was more tolerant at leaf level than other poplar clones, as maintained a high photosynthetic activity. Nevertheless, while poplar clones showed a low cadmium content willow clone exhibited the highest one. Such a discrepancy could be ascribed to a different mobility of heavy metals inside and between cells in the tested clones. Probably, willow bound cadmium in the veins and in necrotic areas on leaf surface without to damage the rest of the leaf blade, while poplars showed a wide diffusion of the damage.L'esistenza di siti contaminati, in numero sempre crescente, pone seri problemi gestionali e comporta spesso la perdita di risorse importanti, sotto forma di suoli e acque che non possono essere utilizzati. Il risanamento con tecnologie convenzionali è a volte proibitivo per motivi economici o per la resistenza dell'opinione pubblica, ma rimane spesso l'unica possibilità. Sono da diversi anni studiate tecnologie biologiche di risanamento, biorimediazione e fitorimediazione, che possono fornire risultati accettabili con un minore impatto ambientale, anche se a volte con tempi più lunghi. In particolare, l'uso di piante superiori per la decontaminazione è limitato per carenze normative, ma anche per la mancanza di specie vegetali veramente efficaci nei confronti di determinati inquinanti. L’obiettivo principale di questa tesi è stato di accrescere le potenzialità di risanamento ambientale mediante sistemi biologici. A tale scopo si ritiene che le Salicacee possano contribuire a questo obiettivo per alcune importanti ragioni: 1) pioppi e salici sono piante a rapido accrescimento, elevata produzione di biomassa, alta capacità traspirativa e facilmente propagabili per talea; 2) esistono evidenze sperimentali di una grande variabilità genetica tra specie ed entro le specie per quanto riguarda la capacità di assorbimento, di mobilizzazione dei metalli all'interno della pianta e di allocazione di questi inquinanti verso i diversi organi vegetali; 3) esiste un'ampia disponibilità di germoplasma per entrambi i generi che include sia ibridi inter- e intraspecifici, in parte di provenienza esotica, sia specie della flora nazionale. In questo contesto, l’obiettivo specifico è stato quello di valutare, attraverso una selezione effettuata in coltura idroponica, la capacità di fitorimediazione di alcuni cloni di pioppo e salice per accumulo, traslocazione e tolleranza al cadmio. In talee radicate esposte per tre settimane in camera di crescita in presenza di solfato di cadmio 50 μM, sono stati misurati i parametri fisiologici e il contenuto e la distribuzione del metallo nelle varie parti della pianta. I risultati hanno permesso di selezionare alcuni cloni che sono in grado di sopravvivere, crescere ed accumulare il cadmio meglio di altri. Infatti questi cloni si sono adattati alla presenza del cadmio, attraverso modifiche nella crescita e nella fisiologia, come il mantenimento di una elevata attività fotosintetica e traspirativa, una distribuzione del metallo alle radici o al fusto, lo sviluppo di meccanismi protettivi e il cambiamento della distribuzione della biomassa ai vari organi. I cloni di pioppo, con caratteristiche simili di accumulo, distribuzione e tolleranza al cadmio, sono stati classificati attraverso l’analisi gerarchica dei cluster. Inoltre, sono stati analizzati l’indice di tolleranza (Ti), il fattore di bio-concentrazione (BCF) e il fattore di traslocazione (Tf) per confrontare il comportamento dei cloni di pioppo e salice per quanto riguarda accumulo, traslocazione alla parte aerea e tolleranza al cadmio. In media, i cloni di pioppo hanno mostrato una capacità due volte più elevata di rimuovere il metallo dalla soluzione rispetto ai salici, espressa come BCF totale. D’altra parte i cloni di salice hanno evidenziato una capacità più che doppia di accumulare il metallo nella parte aerea della pianta rispetto ai pioppi, espressa come Tf. Il confronto fra le due specie per quanto riguarda la tolleranza al cadmio è stata valutata attraverso l’analisi del Ti. Considerando il peso totale della biomassa secca, come media di tutti i cloni analizzati, il Ti ha mostrato che i salici risultano moto più tolleranti al cadmio dei pioppi. Infine, sono stati esaminati gli effetti del cadmio su alcuni cloni di pioppo e salice con differente capacità di traslocazione del metallo alle foglie, attraverso l’analisi delle immagini di fluorescenza della clorofilla, per caratterizzare il danno causato dal metallo a livello fogliare. Questa tecnica si è rivelata capace di mostrare cambiamenti spaziali e temporali durante lo sviluppo dello stress come pure gli effetti ambientali su alcuni aspetti legati alla fisiologia della pianta. Per questo studio sono stati utilizzati cloni di pioppo e salice con un crescente contenuto di cadmio nelle foglie. I risultati hanno indicato che il clone di salice è risultato più tollerante rispetto agli altri cloni, in quanto ha mantenuto una elevata attività fotosintetica. Tuttavia, mentre i cloni di pioppo, avevano un basso contenuto di cadmio il clone di salice aveva il contenuto più elevato. Un tale disaccordo potrebbe essere attribuito ad una differente mobilità dei metalli all’interno e tra le cellule dei cloni analizzati. Probabilmente, il salice ha confinato il metallo nelle venature e nelle aree necrotiche sulla superficie fogliare senza danneggiare il resto della lamina fogliare, mentre i pioppi hanno mostrato un’ampia diffusione del danno