Ritardo di sviluppo di coorti di Xenopus laevis in prometamorfosi esposte a campi magnetici a bassa frequenza e confronto del contenuto di melatonina retinica tra esposti e controlli

Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulareRitardo di sviluppo di coorti di Xenopus laevis in prometamorfosi esposte a campi magnetici a bassa frequenza e confronto del contenuto di melatonina retinica tra esposti e controll. Lo scopo della mia Tesi di Dottorato di Ricerca era di confermare, mediante esperimenti, che l’esposizione di girini di Xenopus laevis (Daudin) a deboli campo a bassa frequenza può rallentare lo sviluppo ontogenetico di questi animali, verificare l’esistenza di particolari combinazioni di ampiezza-frequenza del campo magnetico in grado di promuovere questo fenomeno, e tentare, sempre sperimentalmente, di comprendere se la melatonina possa avere il ruolo di molecola ‘target’ per l’energia magnetica. Ho proposto questa ricerca sulla base dei risultati di una precedente, in cui il mio tutor aveva osservato un ritardo significativo (P <0.001) della metamorfosi in girini di X. laevis esposti al campo magnetico di un apparecchio televisivo[Severini et al., 2003]. E’ noto che il televisore possiede un campo magnetico con forma d’onda a ‘dente di sega’, costituito da differenti componenti armoniche; pertanto, non è possibile definire quale combinazione(i) di frequenza-ampiezza emessa dal televisore è responsabile del ritardo di maturazione osservato. Al fine di comprendere il ruolo delle differenti combinazioni di frequenzaampiezza nel causare ritardo di sviluppo in X. laevis, è stato progettato e costruito un solenoide in cui potessero essere posizionati gli acquari contenti i girini per esposizioni prolungate. Impiegando questo solenoide come sorgente di campo magnetico sono stati eseguiti sei esperimenti: tre durante il primo anno ed i restanti tre durante il secondo. Nel terzo anno, quando è stato preso in considerazione il ruolo della melatonina, i girini sono stati esposti al campo magnetico emesso da un apparecchio televisivo, come nei precedenti esperimenti condotti da Severini. Nei tre esperimenti del primo anno, sono state allevate quattro coorti di 35 girini in acquari nelle stesse condizioni (di temperatura, disponibilità d’acqua, dieta e fotoperiodo). Due delle quali erano esposte all’interno del solenoide a due combinazioni leggermente differenti di frequenza ed intensità del campo magnetico: (50 Hz, 71.1 μT rms) e (50 Hz, 73.7 μT rms), rispettivamente. Le alter due coorti, quelle di controllo, erano esposte al campo geomagnetico statico (20,6 μT) ed al campo variabile di fondo (0.05 μT) [Severini, Alilla et al., in review]. I risultati dell’analisi statistica ANOVA a due vie mostrano che il campo magnetico ELF più intenso (73.7 μT rms) causa un ritardo di sviluppo altamente significativo (4.05 giorni, P <0.001) rispetto ai controlli, mentre il ritardo dovuto al campo più debole (71.1 μT rms) è inferiore (1.57 giorni) e non significativo (P < .40). Questo 118 risultato non conferma solo che l’esposizione al campo magnetico rallenta lo sviluppo dei girini, ma suggerisce inoltre l’esistenza di una soglia di intensità tra 71 μT rms e 74 μT rms (rispettivamente di ampiezza 100 μT e 104 μT) associata all’esposizione dei girini ad un campo magnetico a 50 Hz. In ognuno dei tre esperimenti del secondo anno, due coorti erano esposte alle stesse combinazioni di frequenza-ampiezza del campo generato all’interno del solenoide: (50 Hz, 71.1 μT rms) and (50 Hz, 73.7 μT rms) con una sola differenza rispetto agli esperimenti del primo anno. Nella prima serie il campo statico (geomagnetico) era (20,6 μT), nella seconda il campo statico all’interno del solenoide è stato aumentato fino a raggiungere 65 μT. Questa operazione è stata eseguita per condurre la seconda serie di esperimenti in condizioni di risonanza di ciclotrone del Ca2+, in accordo con la teoria di Liboff [Liboff, 1985], e capire se questa teoria può spiegare (almeno in parte) i ritardi osservati. I risultati mostrano che il campo magnetico alla frequenza di risonanza di ciclotrone del Ca2+ ha prodotto un ritardo di sviluppo significativo (0.86 days, P<.05), benché inferiore a quello della prima serie. Confrontando i risultati dell’ultima serie di esperimenti con quelli della prima, possiamo escludere che gli ioni calcio giochino un ruolo importante nel ritardare la metamorfosi in condizioni di risonanza. Ciò è in accordo con la critica principale alla teoria di Liboff, per la quale l’agitazione termica delle molecole nella materia distrugge gli effetti della risonanza di ciclotrone [Adair, 1991]. In conclusione, gli ioni calcio non possono essere considerati come molecole ‘target’ dei fotoni elettromagnetici nella materia biologica. Nel tentative di trovare un mediatore biologico tra la radiazione elettromagnetica ad onda lunga ed il ritardo di sviluppo, il terzo anno della mia ricerca è stato dedicato ad indagare il ruolo svolto dalla melatonina. Negli Anfibi, la metamorfosi è indotta da una graduale crescita dell’ormone tiroideo (TH) fino a raggiungere un picco al climax metamorfico. La melatonina ha un effetto inibitorio diretto sull’ormone tiroideo in tutti gli stadi di sviluppo [Wright et al., 2000] and ed è considerata un mediatore dell’azione dei campi elettromagnetici [Reiter, 1998]. Nei miei due esperimenti ho esposto una coorte di girini di X. laevis al campo magnetico emesso da un apparecchi televisivo, come negli esperimenti di Severini [2003]. Gli espianti delle retine di Xenopus sono iniziate durante la prometamorfosi circa allo stadio 55, secondo la classificazione di Nieuwkoop & Faber [1956], e le concentrazioni di melatonina sono state determinate mediante un test ELISA (IBL-Hamburg). I risultati mostrano che nelle retine di Xenopus la melatonina presenta un ritmo circadiano di sintesi 119 con livelli elevate di notte e livelli bassi di giorno. Fino ad ora, era noto che le retina di X. laevis sintetizzasse e rilasciasse la melatonina miticamente in stadi precoci della vita embrionale e larvale (26 e 47) [Green et al,. 1999]; i nostri risultati mostrano che ciò avviene anche in prometamorfosi. L’esposizione al campo magnetico del televisore ha causato un rallentamento dello sviluppo già rilevabile tre settimane dopo l’oviposizione, tuttavia, la differenza tra le concentrazioni di melatonina degli esposti e dei controlli non risulta significativa. E’ noto che le concentrazioni di melatonina diminuiscono quando i girini di X. laevis si avvicinano alla metamorfosi, e presumibilmente, anche le differenze tra esposti e non esposti tendono a diminuire. Come conseguenza, il numero di retine espiantate deve aumentare nell’intento di mostrare una differenza tra la concentrazione di melatonina retinica dei girini esposti e non.Developmental delay of Xenopus laevis cohorts in prometamorphosis exposed to weak low frequency magnetic fields and comparison of retina’s melatonin concentration between exposed and control cohorts. Objective of my doctor’s degree thesis was to confirm by experiments that exposure of Xenopus laevis (Daudin) tadpoles to weak low frequency magnetic fields can slow down animal’s ontogenetic development, to check particular amplitude-frequency combinations of magnetic fields in promoting this phenomenon, and to attempt, still through experiments, understanding if melatonin can be considered as a target molecule of magnetic energy. I proposed this research starting from the results of a previous one, in which my tutor observed a significant (P <0.001) metamorphosis delay in X. laevis tadpoles exposed to the magnetic field of a TV set [Severini et al., 2003]. It is well known that TV magnetic field has a ‘saw-tooth’ shape, and that it consists of different harmonic components; then, it is not possible to ascertain which frequency-amplitude combination(s) of TV magnetic field is responsible of the observed maturation retard. In order to check the role of different amplitude-frequency magnetic field combinations in causing X. laevis developmental retard, a tuneable solenoid in which aquariums with tadpoles can be lodged for long (toxic) exposures was planned and constructed. With this solenoid as magnetic field source were performed six experiments: three in the first year and the remaining three in the second. In the third year, when the role of melatonin was taken into consideration, tadpoles were exposed to a magnetic field emitted from a TV device, as in the former Severini’s experiments. In the three experiments of the first year, four cohorts of 35 tadpoles were reared in aquariums in comparable conditions (of temperature, water availability, feeding and photoperiod). Two of them were exposed inside the solenoid to two slightly different combination of magnetic field frequency and intensity: (50 Hz, 71.1 μT rms) and (50 Hz, 73.7 μT rms), respectively. The remaining two cohorts, the control ones, were exposed to static geomagnetic field (20,6 μT) and background variable field (0.05 μT) [Severini, Alilla et al., in review]. The statistical analysis of results via two way ANOVA shows that the strongest ELF magnetic field (73.7 μT rms) causes a highly significant metamorphosis delay (4.05 days, P < 0.001) with respect to the controls, whereas the retard caused from the weakest one (71.1 μT rms) is smaller (1.57 days) and not significant (P <.40). This result not only confirms that magnetic exposure can slow down tadpoles development, but it also suggests that a sharp intensity threshold between 71 μT rms and 74 μT rms 115 (amplitude 100 μT and 104 μT) must exist in considering developmental retards associated to exposures to 50 Hz electromagnetic fields. In each of the three experiments of the second year, two cohorts were exposed to the same frequency-intensity combinations of magnetic field in the solenoid: (50 Hz, 71.1 μT rms) and (50 Hz, 73.7 μT rms) with the following difference as to the first year. Then, the constant static (geomagnetic) field was (20,6 μT), while in the new series of experiments the constant static magnetic field in the solenoid was augmented artificially up to 65 μT. This was done to perform this series of experiments in condition of Ca2+ cyclotron resonance, according to Liboff’s theory [Liboff, 1985] and to check if this theory could explain (at least partially) the observed retards. The results show that the magnetic field Ca2+ cyclotron resonance produced a significant developmental delay (0.86 days, P<.05), though shorter than that of the first series. Comparing the results of the last three experiments in the solenoid to the former three, we can exclude that calcium ions play an important role in retarding metamorphosis via cyclotronic resonance. This is in agreement with the main criticism of the Liboff’s theory, according to which thermal molecular agitation in matter destroys the effects of cyclotronic resonance [Adair, 1991]. In conclusion, cellular calcium ions cannot be considered as target molecules of electromagnetic photons in biological matter. In attempt to find a biological mediator between electromagnetic long wave radiation and developmental delay, the third year of my research was dedicated to investigate the role of melatonin. In Amphibians, metamorphosis is induced by a gradual rise in the thyroid hormones (TH) that get to their maximum values during metamorphic climax. Melatonin has an inhibitory effect on the thyroid hormones in all stages of the life cycle [Wright et al., 2000] and it is considered a mediator of electromagnetic fields [Reiter, 1998]. In my two experiments I exposed a cohort of X. laevis tadpoles to the magnetic field emitted by a TV set, as in Severini’s experiment [2003]. Removal of Xenopus retinas started during animal’s prometamorphosis about at stage 55, according to Nieuwkoop & Faber classification [1956], and melatonin concentrations was measured by the ELISA (IBL-Hamburg) test. The results show that melatonin in Xenopus retinas has a circadian rhythm of synthesis with high levels at night and low levels during the day. Up to now, it was known that X. laevis retinas synthesize and release melatonin rhythmically in early embryonic and larval stages (26 and 47) [Green et al,. 1999]; our results show that this happens also in prometamorphosis. The exposure to the TV set magnetic field caused a developmental slow down already significant three weeks after 116 oviposition, however, the difference between melatonin concentrations of exposed and unexposed cohorts does not result significant. It is known that melatonin concentrations decrease as X. laevis tadpoles approach metamorphosis, and presumably, differences in melatonin concentrations between exposed and not exposed tadpoles progressively diminish. As consequence, the number of removed retinas must increase with respect to as we did in order to show a difference of retinal melatonin concentration between exposed and not exposed tadpoles