Caratterizzazione di laccasi native e modificate e loro uso nella degradazione di coloranti

Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimicaLe laccasi (benzenediolo:ossigeno ossidoreduttasi; EC 1.10.3.2) appartengono alla famiglia enzimatica delle “multicopper oxidases”, anche dette “blue oxidases” a causa del loro caratteristico colore. In natura sono distribuite principalmente nei funghi, in particolare nei basidiomiceti white-rot, ma sono presenti anche nei batteri, negli insetti e in molte specie di piante. Strutturalmente sono glicoproteine monomeriche o multimeriche, con differente contenuto di carboidrati e di atomi di rame. Le laccasi fungine contengono quattro atomi di Cu(II) dalle diverse proprietà spettroscopiche (rame di tipo1, di tipo2 e di tipo3) essenziali per l’attività enzimatica. Il rame di tipo 1 presenta un’intensa banda di assorbimento nello spettro visibile a circa 600 nm, dovuta al legame covalente tra rame e cisteina, e conferisce il caratteristico colore blu alle ossidasi multirame (Nakamura, 1958; Malmstrom et al., 1968); è proprio a livello del sito 1 che si realizza l’ossidazione del substrato. Il rame di tipo 2, invece, non è rilevabile nello spettro visibile ma presenta proprietà paramagnetiche se analizzato tramite spettroscopia EPR. I due ioni rame di tipo 3 sono organizzati in un centro binucleare caratterizzato da una banda di assorbimento a 330 nm (nella forma ossidata) e dall’assenza di segnale EPR poiché sono fortemente accoppiati e legati a ponte da un ossidrile. Gli ioni rame di tipo 2 e di tipo 3 sono organizzati in un cluster trinucleare a livello del quale si realizza la riduzione dell’ossigeno molecolare ed il rilascio di acqua. Il trasferimento degli elettroni dal centro mononucleare T1 al centro trinucleare T2/T3 segue un percorso formato da residui di istidina che formano legami di coordinazione con gli ioni rame del centro 3 e da residui di cisteina formanti legami con lo ione rame del centro 1 (Reinhammar, 1997). Le laccasi sono p-difenolossidasi che catalizzano l’ossidazione di numerosi composti aromatici con la concomitante riduzione di ossigeno molecolare ad acqua. Grazie alla bassa specificità di substrato le laccasi sono enzimi molto versatili; in particolare catalizzano l’ossidazione di para-difenoli, polifenoli, metossifenoli, amminofenoli, diammine, poliammine, arilammine, etc., compresi pesticidi, idrocarburi policiclici aromatici, coloranti. e anche di alcuni ioni inorganici (es. Mn²+ e I-); (Rodriguez Couto et al., 2006). Inoltre è stato osservato che substrati delle laccasi, come 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), 1-idrossibenzotriazolo (HBT) o acido violurico (VA), possono agire da mediatori velocizzando notevolmente la reazione su altri prodotti e rendendo possibile l’ossidazione di composti che altrimenti non sarebbero substrato di questo enzima (Li et al.,1999; Johannes et al., 2000). In questi casi il mediatore viene ossidato generando un 2 prodotto fortemente reattivo, generalmente un radicale stabile, che agisce poi sul secondo composto. Per il tipo di reazione catalizzata, le laccasi sono state proposte per numerose applicazioni (industria della carta, alimentare, chimica, farmaceutica, cosmetica, tessile, dei coloranti, per biosensori, biorisanamento, etc.) Dal momento che la laccasi è in grado di ossidare molti composti colorati può essere adoperata efficacemente per il trattamento di reflui che li contengono, ed è proprio questo il campo verso cui sono state rivolte molte delle nostre indagini. I coloranti sintetici, largamente utilizzati in numerosi settori industriali, sono prodotti in grandi quantità e il loro rilascio nell’ambiente è causa di inquinamento e costituisce un fattore di rischio per la salute. I coloranti presentano un’ampia diversità strutturale: le classi di composti chimici più frequentemente impiegate sono di tipo azoico, ma sono adoperati anche composti antrachinonici, indigoidi e triarilmetani. Numerosi metodi fisici, come l’adsorbimento su matrici, sono stati sviluppati per il trattamento dei reflui, ma non sono selettivi e spesso sono poco efficienti. Invece, l’utilizzo di microrganismi o comunque di enzimi ossidativi è una tecnologia alternativa che presenta numerosi vantaggi quali l’abbattimento dei costi di processo e la completa mineralizzazione degli inquinanti a molecole non tossiche. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di individuare e caratterizzare laccasi native o modificate per applicazioni biotecnologiche, in particolare per la decolorazione. A tal fine sono state seguite tre vie principali: purificazione e caratterizzazione di laccasi prodotte dal fungo basidiomicete Trametes trogii; isolamento e clonaggio di un nuovo gene laccasico e caratterizzazione del suo prodotto; produzione e caratterizzazione di mutanti della laccasi principale prodotta da T.trogii. Trametes trogii, come altri funghi white-rot, rilascia nel terreno di coltura diverse laccasi. Sono state individuate sei diverse isoforme di cui la principale (Lcc1) costituisce circa il 90% dell’attività laccasica. Allo scopo di indagare se le isoforme secondarie presentassero caratteristiche diverse dall’isoforma principale abbiamo analizzato la dipendenza dell’attività dal pH di 2 isoenzimi minoritari (P5 e P6) con 2 substrati di tipo fenolico (DMP e guaiacolo) e uno non fenolico (ABTS). Mentre l’isoforma P5 mostra dei profili sovrapponibili a quelli di Lcc1, l’isoforma P6 mostra, con i substrati fenolici, uno spostamento del massimo di attività verso pH più vicini alla neutralità. L’isoenzima P6 potrebbe essere quindi interessante per applicazioni in campi in cui non possono essere utilizzate condizioni di reazione particolarmente acide. Come si è visto, almeno una delle isoforme minoritarie prodotte da T. trogii ha caratteristiche che potrebbero essere interessanti in applicazioni biotecnologiche. Tuttavia la 3 loro purificazione e caratterizzazione richiede tempo poiché rappresentano complessivamente meno del 10% dell'attività laccasica totale. A questo scopo, sono stati isolati da T.trogii nuovi geni laccasici; uno dei quali, lcc2, è stato espresso in Pichia pastoris e la proteina ricombinante ottenuta è stata caratterizzata. Dedotta la struttura primaria dalla sequenza genica di lcc2, ne è stato costruito un modello 3-D sulla base delle coordinate tridimensionali della laccasi omologa Lcc1 e si sono messe in relazione variazioni strutturali con le diverse caratteristiche chimico-fisiche delle due isoforme. La proteina ricombinante Lcc2 presenta caratteristiche catalitiche diverse da Lcc1, che la rendono particolarmente interessante dal punto di vista applicativo. Lcc2 presenta, infatti, un pH ottimale per i substrati fenolici DMP e guaiacolo spostato di 1 e 2 unità verso la neutralità rispetto a Lcc1, e conserva ancora circa il 40% della sua attività a pH 6.0 e questo spostamento, a differenza di quanto accade per i mutanti, non coincide con una diminuzione dell’attività specifica. Lcc2 mostra una cavità del substrato molto simile a quelle di altre laccasi con i due residui dell'acido aspartico e dell'istidina altamente conservati. La principale differenza riguarda due residui spazialmente vicini che circondano la cavità del substrato: Thr 164 e Ser 264 di Lcc1 sono sostituiti in Lcc2 da due residui idrofobici Phe 163 e Ile 265, rispettivamente. Questa variazione influenza la capacità di Lcc2 di interagire con i ligandi. L'efficienza catalitica di Lcc2 verso i ligandi ingombranti che trasportano gruppi polari (per esempio ABTS) diminuisce significativamente, sia a causa di un aumento della KM che alla diminuzione della kcat indicando una concomitante diminuzione nell'affinità per il substrato e nella cinetica di trasferimento dell'elettrone. Per contro, l'efficienza catalitica di Lcc2 verso i piccoli substrati idrofobici (per esempio guaiacolo e DMP) mostra una diminuzione moderata rispetto a Lcc1, dovuta principalmente a un aumento di circa 5 volte nell'affinità per i substrati. L'aumento nell'affinità di Lcc2, rispetto a Lcc1, verso i ligandi idrofobici che sono all’interno della cavità del substrato potrebbe essere dovuto a un movimento indotto di chiusura della cavità principale dovuto ai residui amminoacidici idrofobici che si trovano sul bordo della cavità. La diminuzione di kcat osservata in Lcc2, rispetto a Lcc1, indica che il trasferimento dell'elettrone dal substrato al rame T1 (lo step che limita la velocità di reazione nella cinetica della laccasi) deve essere influenzato dalle differenze strutturali che esistono fra le due isoforme di laccasi; tuttavia, non può escludersi che siano stati influenzati anche il trasferimento interno dell'elettrone dal rame T1 al centro trinucleare T2T3 e poi alla molecola di ossigeno, e il rilascio del prodotto. Sempre con lo scopo di individuare varianti delle laccasi con caratteristiche vantaggiose per l’impiego in bioprocessi, come pH ottimali più vicini alla neutralità, sono stati progettati esperimenti di mutagenesi sito-diretta a carico dell’Asp205 che potrebbe influire sul pH 4 ottimale dell’enzima. Sono state poi effettuate delle analisi comparative per valutare eventuali modifiche delle caratteristiche catalitiche della Lcc1 ricombinante e delle laccasi mutate rispetto a quelle della Lcc1 nativa. I risultati indicano che la sostituzione dell’Asp205 con amminoacidi polari non carichi o carichi positivamente determina uno spostamento dei valori di pH ottimali verso la neutralità e che questo residuo amminoacidico risulta particolarmente importante per l’attività specifica delle laccasi. Come già accennato in precedenza, le laccasi mutate presentano però una bassa attività specifica rispetto all’enzima nativo. Per valutare le potenzialità applicative delle laccasi sono state effettuate prove di degradazione di composti fenolici e di coloranti prima utilizzando la laccasi maggioritaria Lcc1 di T. trogii immobilizzata, e poi con l’enzima libero. Sono stati effettuati test di screening su microtiter su coloranti appartenenti a diverse classi: azoici (amaranto, carmoisina, new coccine, sunset yellow), antrachinonici (remazol brilliant blueR), triarilmetano (patent blue) e indigoidi (indigo), ottenendo valide indicazioni sui prodotti maggiormente modificati dall’enzima e sui coloranti la cui degradazione richiede la presenza di un mediatore. Infine utilizzando la metodologia delle superfici di risposta (RSM) si è ottimizzato il processo di decolorazione da parte di Lcc1 su due coloranti appartenenti alle due principali classi di coloranti utilizzate dall’industria tessile (amaranto e remazol brilliant blue R). L’analisi RSM consente di analizzare diverse variabili contemporaneamente e di effettuare scelte razionali delle condizioni operative a seconda della necessità, mostrando che, in opportune condizioni, è possibile operare a pH più vicini alla neutralità.Laccases (benzenediol:oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2) belong to the family of “multicopper oxidases”. Laccases were discovered in plants, then have been described in fungi, insects and, more recently, in prokaryotes. They are thought to be nearly ubiquitous among fungi, mainly in the wood-rotting basidiomycetes causing white-rot, where they are usually produced in multiple isoforms as extracellular proteins. Laccases are involved in several physiological functions, such as lignin biosynthesis, plant pathogenesis, insect sclerotisation, and degradation of lignocellulosic materials. The cultural broth of laccaseproducing fungi contains generally a main laccase and a number of isoforms some of which closely related, others differing for structural and catalytic properties. The production of different isoenzymes is due to the occurrence of multiple laccase genes; it is known that the expression of some of these genes is regulated up by the presence in the culture medium of specific inducers such as copper, ferulic acid or 2,5-xylidine. Most fungal laccases are monomeric glycoproteins with molecular masses ranging between 60,000 and 70,000 Da and the extent of glycosylation between 10 and 25%; they catalyze the one-electron oxidation of a large variety of substrates (usually diphenols or aromatic amines) coupled with the reduction of dioxygen to two molecules of water. In the blue laccases, the redox process is brought about by four copper ions arranged in three different centres. One type-1 (T1) copper ion is characterized by a strong absorption nearly 600 nm which is responsible of the intense blue colour of these proteins; T1 copper shows a trigonal coordination, with two histidine and a cysteine residues as conserved ligands; either a leucine or a phenylalanine residue occupies the fourth ligand position in fungal laccases. The coordination geometry and ligand nature of T1 copper might be responsible of the high redox potential of fungal laccases, as compared to plant laccases and other blue copper oxidases. A second copper ion, coded as type-2 (T2), has a weak absorption in the visible region, is electron paramagnetic resonance (EPR)-active and is coordinated by two histidine residues. The last two copper ions [type-3, (T3)] form a binuclear centre characterized by an absorption at 330 nm; they are EPR-silent due to an antiferromagnetic coupling mediated by a hydroxyl bridge. The two T3 copper ions are coordinated by six histidine residues and are positioned close to the T2 copper ion to form a trinuclear cluster. T1 copper is the site where the substrate oxidation occurs; the extracted electrons are transferred, probably through a strongly conserved HisCysHis tripeptide motif, to the T2T3 trinuclear cluster, where dioxygen is reduced to water. 6 Laccase are very versatile enzymes, being able to oxidize an extensive list of aromatic compounds containing hydroxy or amino groups, including pesticides, polycyclic aromatic hydrocarbons and dyes. Further, the presence of small molecular weight redox mediators such as 2,2_-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), violuric acid (VA) and 1- hydroxybenzotriazole (1-HBT), enhances the range and the rates of compounds to be oxidized (including recalcitrant dyes). These properties make laccases good candidates for applications in the pulp and paper industry, textile industry, biosensor development, bioremediation of polluted water and soil. The great interest that laccases aroused for biotechnological uses has promoted intense investigations for clarifying their oxidative mechanism and for discovering new enzymes with desirable characteristics and the molecular determinants able to modulate enzyme properties for specific applications. For many applications it is important to find an enzyme that is thermostable and works at relatively high pH-value. The objective of this thesis is the characterization of native and modified laccases for biotechnological applications, as dye decolourization. To such aim, three main ways have been continuations: characterization of native laccases secreted from the fungus basidiomycete Trametes trogii; isolation and expression of new T. trogii laccase genes; production and characterization of mutants of the main T. trogii laccase. Trametes trogii, a typical basidiomycete, produces at least five laccase isoforms; the main isozyme, coded as Lcc1, has been purified and characterized. It could be of interest to analyze role and properties of the other isoforms, but their purification and characterization is time-consuming since they account altogether for less than 10% of the total laccase activity. However, two T. trogii laccase isoforms (coded as P5 and P6) have been partially purified and characterized in comparison to Lcc1; in particular the profile pH/activity show that P6 has an optimal activity shifted toward neutrality for phenolic substrates (about 0.5 and 1.0 pH units for DMP and guaiacol, respectively, as compared to Lcc1) To find easier ways to produce laccase isoforms, we have looked for new laccaseencoding genes in the T. trogii cDNA using degenerate primers designed on conserved regions of basidiomycete laccases; a laccase gene, coded as lcc2, has been isolated, cloned, sequenced and expressed in the heterologous host Pichia pastoris. The product of lcc2 (Lcc2) has an interesting behaviour towards aromatic substrates exhibiting an optimal pH closer to the neutrality than Lcc1; in particular Lcc2 shows a shift towards higher pH values, as compared to Lcc1, of 2.0 and 1.0 units for DMP and guaiacol, respectively. It is worthwhile to note that the whole pH/activity profile of Lcc2 with phenolic substrates appears shifted towards values closer to neutrality, so that the enzyme conserves about 40% of its activity at 7 pH 6. Finally, at the optimum pH, Lcc2 shows a higher affinity (lower Km values) towards the phenolic substrates, as compared to Lcc1. The three-dimensional structure of Lcc1 laccase from T. trogii was used as a template for the construction of the Lcc2 model. Lcc2 shows a substrate cavity very similar to those of the so far laccases crystallized; the aspartic acid residue is conserved and is very close to the histidine residue. A main difference is observed between Lcc1 and Lcc2 with regard to two spatially close residues surrounding the substrate cavity: Thr 164 and Ser 264 of Lcc1 are replaced in Lcc2 by the two hydrophobic residues Phe 163 and Ile 265, respectively. This variation affects in same way the capacity of Lcc2 to interact with ligands. The catalytic efficiency of Lcc2 towards bulky ligands carrying polar groups (e.g. ABTS) decreases significantly due to both an increase in Km and a decrease in kcat, indicating a concomitant decrease in the affinity for the substrate and in the kinetics of electron transfer. Conversely, the catalytic efficiency of Lcc2 towards small hydrophobic substrates (e.g. guaiacol, DMP) shows a moderate decrease as compared to Lcc1, due to an about 5-fold increase in the affinity for the substrates and to a more sensible decrease in kcat (Table 1). The increase in affinity of Lcc2, as compared to Lcc1, towards hydrophobic ligands which are embedded in the substrate cavity could be due to an induced-fit closing movement of the cavity led by the amino acid residues of the border loops closer to the ligand. The decrease in kcat observed in Lcc2, as compared to Lcc1, indicates that the electron transfer from the substrate to the T1 copper, being the rate-limiting step in laccase kinetics, must have been affected by the structural differences existing between the two laccase isoforms; however, it cannot be excluded that the internal electron transfer from the T1 copper to the T2T3 trinuclear cluster and then to the dioxygen molecule and the product release have been affected. Laccase biotransformation of xenobiotics in natural media suffers from two main limitations of the enzyme: an acidic optimal pH for activity and the requirement in several cases for a redox mediator. The modification of these laccase properties should be achieved through a site-directed mutagenesis strategy. On the basis of previous structural analyses of the amino acid residues surrounding the active site of the laccase IIIb from T. versicolor, it was suggested that the histidine in position 458, that also coordinate the T1 copper, acts as the primary electron acceptor from the substrate, and the aspartate in position 205 is hydrogen bonded via the terminal oxygen of its side chain to the reducing substrate and influence the dependence of the activity towards pH. In addition it was observed that this acidic residue is highly conserved among fungal laccases and is expected to play an important role in the structure and function of the enzyme. In the current study the Asp205 of Lcc1 from T. trogii 8 was mutated in amino acids with different chemical properties: Ser or Cys, non charged polar residues, Lys, a positively charged residue. The pH/activity profiles of the mutated laccases with phenolic substrates indicated a shift of the optimal pH towards neutrality while maintaining the characteristic bell shape curve. However, it is important to note that the specific activity of the tested mutants was significantly lower than that of the wild type at all pH levels and the catalytic improvement at pH closer to neutrality could be associated with a much reduced efficiency at acidic values of pH. The presence of a negatively charged residue close to the substrate binding pocket could stabilize the radical cation formed following electron subtraction and the absence of the Asp205 residue determined a significant decrease in the specific activity of the mutated enzymes. Degradation experiments of phenolic compounds and of a number of dyes with free and immobilized Lcc1 have shown that this laccase has a wide oxidizing capacity; many recalcitrant compounds may be degraded in the presence of an appropriate mediator. Preliminary screening experiments of decolourization on microtiter plates have been carried out on various structurally different dyes: azo (amaranth, carmoisine, new coccine, sunset yellow), anthraquinonic (remazol brilliant blue R), triarylmethane (patent blue) and indigoid (indigo). Finally, the process of decolourization has been optimized for amaranth and remazol brilliant blue R by the response surface methodology (RSM) which allows the monitoring at the same time of a number of variables (enzyme, substrate and mediator concentration, time, pH). These experiments have shown that it is possible to modulate experimental conditions as suitable to reach optimal results; in particular, it is possible to operate at pH closer to neutrality at ap