Structure and Function of the microbial communities in polluted soils: effect of mycoremediation

Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimicaLa diffusa contaminazione di ecosistemi terrestri e acquatici dovuta all’immissione di composti di origine antropica ad elevata persistenza è un problema che sta assumendo una rilevanza sempre maggiore. Date le quantità prodotte e i potenziali effetti negativi sull’ambiente e sulla salute umana il gruppo di composti più importante è quello dei cosiddetti “xenobiotici”, molecole di sintesi ad elevata persistenza ed estranee ai processi biologici. Le tecnologie che, sfruttando la capacità dei microrganismi, batteri, alghe o funghi, di degradare i contaminanti, sono in grado di accelerare i fenomeni naturali di detossificazione dell’ambiente stanno attirando sempre maggiore attenzione (Šašek et al., 2003). In questo senso, i funghi Basidiomiceti appartenenti al gruppo dei white-rot sembrano i più interessanti. Nel biorisanamento è anche fondamentale il ruolo della microflora endogena e fondamentali appaiono le eventuali interazioni con le specie esogene usate per il bioarrichimento. Negli ultimi venti anni, è profondamente cambiato l’approccio metodologico allo studio delle comunità microbiche naturali: sempre più frequente, infatti, è l’utilizzo di metodi indipendenti dalla coltivazione al fine di superare il problema della non coltivabilità della maggior parte dei batteri ambientali. Tranne che nella diretta ibridazione del DNA con sonde specifiche, la maggior parte di tali metodi (DGGE/TGGE, ARDRA, RFLP/T-RFLP, RISA/ARISA, qRT-PCR) si basano sulla’analisi di marcatori genetici amplificati con primers “universali” a partire dal metagenoma estratto direttamente da campioni di suolo, acqua o sedimenti. Il target maggiormente impiegato nello studio della diversità microbica è il gene codificante l’rRNA 16S, ma anche molti geni funzionali sono base per lo studio di subpopolazioni con capacità metaboliche e fisiologiche specifiche (amoA, rpoB, PmoA, nifH). I principali obiettivi della presente tesi di dottorato sono stati lo studio della dinamica della struttura e funzione delle comunità microbiche autoctone in seguito a processi di micorisanamento su scala di laboratorio condotti su due suoli storicamente contaminati, uno da idrocarburi aromatici e l’altro da PCB, ed un suolo modello contaminato “ad hoc” in laboratorio con una miscela di IPA. Sul suolo modello, contaminato in laboratorio con una miscela di ognuno (50 μg/g) dei seguenti di IPA: fenatrene, antracene, fluorantene, pirene, crisene, benzo[k]fluorantene e benzo[a]pirene, è stato valutato l’effetto combinato di agenti II mobilizzanti (AM) e micorisanamento (Irpex lacteus 617/93, Pleurotus ostreatus 3004, Allescheriella sp. DABAC 1 e Phlebia sp. DABAC 9) sulla struttura delle comunità batteriche indigene. Con Allescheriella sp. e Phlebia sp. sono stati utilizzati gli AM Tween20 (TW20), Tween 80 (TW80) e olio di soia (OS). Con I. lacteus e P. ostreatus sono stati usati come AM anche RAMEB (β-ciclodestrine metilate) ed acque di vegetazione delle olive (AV). Con Phlebia sp., l’unico AM in grado di provocare un aumento significativo della deplezione degli IPA, espressa come peso totale dei contaminati residui (TWOC: Tatal Weight of Organic Contaminants), e valutata sia nei controlli di incubazione che nei suoli sottoposti a micorisanamento dopo 45 giorni di incubazione, era l’OS. Con Allescheriella sp., invece, le migliori performance degradative si ottenevano, nel suolo trattato con TW20 ove si raggiungeva una diminuzione del TWOC pari al 21,6% rispetto al biotrattamento fungino senza aggiunta di AM. La detossificazione dei suoli è stati valutata quantificando l’attività deidrogenasica; Phlebia sp. induceva un livello significativo di detossificazione solo in presenza di TW80, mentre nel caso di Allescheriella sp. il livello più elevato era raggiunto quando non erano presenti AM. La microflora batterica coltivabile endogena era diversamente influenzata con effetto negativo di OS e TW80 sia nel controllo di incubazione che nel suolo inoculato con Phlebia sp. mentre con Allescheriella sp. non si osservavano differenze significative in nessuno dei campioni, indipendentemente dall’AM impiegato. In ogni caso, era evidente un generale effetto positivo esercitato dai funghi sullo sviluppo della microflora residente coltivabile. L’analisi DGGE dimostrava che nel controllo di incubazione in assenza di AM, entrambi gli indici di biodiversità stimati, richness e Shannon-Weaver, non differivano significativamente dagli stessi nel suolo pristino. Entrambi questi parametri risultavano comunque aumentati nei controlli di incubazione trattati con gli AM e i valori più elevati erano osservabili nei suoli sottoposti a micorisanamento. In base alla cluster analysis, infine, era evidente come i funghi esercitavano un’influenza decisiva sulla similarità tra le specie batteriche. Tra gli AM impiegati, il maggior impatto era dovuto a TW20 e TW80. Con I. lacteus e P. ostreatus era riscontrabile un’azione diversa degli AM sulle performance degradative: l’OS risultava il migliore ma un effetto positivo sulle potenzialità degradative di I. lacteus e P. ostreatus era esercitato, rispettivamente, anche da TW20 e TW80. III Anche in questo caso, l’OS esercitava il maggior effetto negativo sullo sviluppo della microflora residente, dimostrato anche mediante analisi DGGE: più bassi indici di biodiversità si riscontravano, infatti, nel controllo di incubazione e nel suolo con I. lacteus in presenza di tale surfactante. L’analisi DGGE mostrava, inoltre, che la biodiversità, con P. ostreatus, non aumentava ma era influenzata dal tipo di AM utilizzato. La cluster analysis indicava come l’inoculo del suolo con P. ostreatus esercitava la maggiore influenza sulla similarità tra le popolazioni batteriche; con I. lacteus, invece, il maggior effetto era esercitato dai surfactanti. Il sequenziamento di alcuni cloni, corrispondenti a particolari bande DGGE, mostrava la presenza di specie batteriche, note per le loro capacità di degradare IPA, appartenenti a generi come Bacillus e Burkholderia. P. pulmonarius CBS 664.97 e B. rhodina DABAC P82 sono stati testati su suolo storicamente contaminato sia come tale che fumigato con cloroformio per valutare il contributo della microflora endogena sull’intero processo. Inaspettatamente, B. rhodina colonizzava meglio il non fumigato mentre era vero il contrario con P. pulmonarius. Le performance degradative di entrambi i funghi erano nettamente superiori nei suoli non fumigati rispetto ai fumigati. Per valutare l’effetto del micorisanamento sulla microflora endogena sono state anche effettuate conte dei batteri eterotrofi totali ed analisi DGGE del gene dell’rRNA 16S. Il numero degli eterotrofi totali era superiore nei suoli non fumigati rispetto ai fumigati, soprattutto biotrattati. L’analisi DGGE evidenziava minore biodiversità nel suolo come tale (t0 – tf), rispetto al controllo e ai suoli sottoposti ai trattamenti fungini. I due ceppi sembravano, quindi, aver avuto un significativo effetto sulla struttura della comunità batterica: le specie stimolate a crescere appartenevano infatti a generi noti per l’abilità di degradare idrocarburi aromatici. Un’ulteriore prova di micorisanamento del suolo ACNA è stata condotta con P. tigrinus con prelievi all’inizio della prova (t0) e dopo 7, 15, 30, 60 giorni (t7, t15, t30,t60) di incubazione. Sia da ispezione visiva che da dosaggio dell’ergosterolo (743 μg/g suolo dopo 60 giorni di incubazione) si rilevava veloce colonizzazione del suolo ammendato con la paglia di mais; venivano, inoltre prodotte Laccasi e Mn-perossidasi (6,54 U/g e 182 mU/g suolo, rispettivamente, dopo 30 giorni di incubazione). L’analisi GC-MS del suolo trattato con P. tigrinus mostrava abbattimento di molti dei contaminanti prioritari presenti nel suolo quali: naftalene (57,3%), 1,2,3,4- IV tetraclorobenzene (73,5%), 2,4- e 2,6-dicloroaniline (100 e 82.8%, rispettivamente) e difeniletere (78%). Conte vitali e analisi DGGE mostravano che, nel tempo, si aveva sia aumento del numero dei batteri eterotrofi totali, che incremento della biodiversità. Gli indici di biodiversità subivano infatti un aumento, nel caso del controllo di incubazione, ed in modo più evidente nel suolo biotrattato con il fungo, già dopo 7-15 giorni di incubazione. L’effetto del trattamento fungino, sulla diversità delle popolazioni batteriche, come emerso dalla cluster analysis era invece riscontrabile dopo 30 giorni di incubazione: si ottenevano infatti due sotto-cluster separati che comprendevano, uno i controlli di incubazione t30 e t60 e l’altro i suoli biotrattati con P. tigrinus t30 e t60. Infine, per valutare se vi fossero effetti, in seguito al micorisanamento, anche su alcune funzioni metaboliche espletate dalle popolazioni batteriche, sono state effettuate real-time PCR sui geni codificanti enzimi chiave (naftalene-diossigenasi e catecolo 2,3- diossigenasi) nella degradazione di alcuni IPA al fine di stimare le variazioni nel numero di copie dei geni stessi. Sia nel caso del gene nahAc che del gene C230 si assisteva ad una diminuzione del numero di copie dei geni stessi in seguito al trattamento fungino. P. tigrinus e OS sono stati infine impiegati in un suolo storicamente contaminato da PCB monitorandone nel tempo gli effetti con prelievi all’inizio della prova (t0) e dopo 30 e 60 giorni di incubazione (t30 e t60). Nei suoli biotrattati la crescita fungina era visibile microscopicamente; quantificando l’ergosterolo, veniva rilevata, seppur in esigue quantità, anche nei controlli di incubazione, indicando quindi crescita di specie fungine autoctone. Nei suoli sottoposti a micorisanamento erano inoltre riscontrabili sia attività enzimatiche idrolasiche che ossidasiche. Le prime raggiungevano i livelli più elevati dopo 30 giorni soprattutto in assenza di OS. L’andamento delle attività ossidasiche era sostanzialmente simile alle idrolasi, ma in questo caso l’OS mostrava pesante influenza negativa sulla laccasi e positiva sulla perossidasi Mn-dipendente. Dall’analisi dei dati relativi alle percentuali di deplezione dei congeneri di PCB estratti dai campioni derivati dalle diverse tesi dopo 60 giorni di incubazione e quantificati attraverso GC-MS, erano evidenti differenti tipi di effetti dovuti all’azione della microflora indigena e del fungo esogeno oppure all’aggiunta di OS o stocchi di mais. L’effetto positivo della microflora residente era evidenziato dalla deplezione dei diversi congeneri nei microcosmi; emergeva tuttavia un effetto negativo esercitato dall’OS. Simile effetto sembrava esercitato anche dagli stocchi di mais sulla deplezione V dei PCB da parte delle comunità microbiche autoctone. Infine, l’effetto del fungo, valutato confrontando il controllo d’incubazione ed il suolo bistrattato (con e senza OS), risultava trascurabile. L’impatto del micorisanamento sulla composizione delle popolazioni batteriche autoctone è stato valutato con conte vitali e analisi DGGE. Inoltre, vista la presenza di funghi autoctoni l’analisi è stata condotta anche sui prodotti di amplificazione del gene codificante il 18S rRNA eucariotico. Attraverso le conte si è osservato un graduale aumento del numero di batteri durante i 60 giorni di incubazione: i maggiori livelli di crescita si avevano nei campioni trattati con fungo e OS dimostrandosi così un loro effetto positivo sulla componente coltivabile della microflora endogena. Dalle analisi DGGE dei geni 16S e 18S rDNA si è evidenziato come sia il biotrattamento che l’uso di OS avevano effetto significativo sulla biodiversità sia dei batteri che dei funghi autoctoni, anche non coltivabili. In base ad analisi qRT-PCR dei geni C230 e bph codificante la bifenil-diossigenasi, enzima chiave dell’upper pathway della degradazione aerobica dei PCB, non si osservavano differenze notevoli nel numero di copie; ciò farebbe supporre che a livello funzionale, il fungo non abbia avuto effetti rilevanti sulle popolazioni batteriche coinvolte nella degradazione degli inquinanti presenti. In conclusione, sia la concentrazione che la biodiversità delle popolazioni batteriche endogene mostrano incrementi in seguito ai processi di micorisanamento ad eccezione dei casi in cui si utilizza OS con Phlebia sp. e, indipendentemente dall’AM impiegato, con P. ostreatus. Tutti i funghi utilizzati risultavano efficaci nella decontaminazione e nella detossificazione dei suoli trattati tranne nel caso di P. tigrinus utilizzato su suolo storicamente contaminato da PCB. Le attività degradative batteriche si mostravano coerenti con i risultati di decontaminazione: se il fungo provocava una diminuzione dei livelli di contaminazione, anche i geni catabolici batterici ne erano influenzati, se il fungo non aveva effetti, anche i livelli dei geni catabolici batterici non subivano cambiamenti durante il trattamento.In the recent years, several polluting compounds have been released into the environment because of industrial and agricultural activities and represent a threat to humans and other living organisms. These contaminants are either natural compounds that have been mobilized to a bioavailable form that is toxic to organisms, such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) present in fossil fuels and heavy metals present in minerals, or compounds of industrial origin that present chemical structures alien to the biosphere (xenobiotics), such as polychlorobiphenyls (PCBs). To address the challenge of cleaning up contaminated sites, there has been an increasing interest in biological methodologies, collectively indicated as bioremediation, that take advantage of the astonishing catabolic versatility of microorganisms to degrade or transform contaminants to less toxic or nontoxic products. A promising bioremediation approach is represented by the use of white-rot fungi, due to their unspecific, radical-based degradation machinery that mainly operates in the extracellular environment (mycoremediation). A better understanding of the structure and functions of the microbial communities of a given contaminated site and how they are affected by biotechnological interventions, such as bioaugmentation with fungi and/or addition of mobilizing agents, may assist in the design of more appropriate remediation strategies. In these respects, the increased development of molecular-based techniques, mainly based on the isolation and analysis of the genome of the entire microbial community in an environmental sample (the so called ‘metagenome’), has allowed the direct investigation of microorganisms in their natural environment without laboratory culturing and thus allowing to mine the whole microbial diversity, including the vast uncultivable majority. Considering that white-rot fungi have been successfully employed in several bioremediation trials but that little is known about whether and how the indigenous microflora is affected by the massive inoculation with the allochtonous fungi, the aim of the present Ph.D. thesis project was to investigate the structural and functional modifications of the microbial communities in contaminated soils following mycoremediation. In particular, several laboratory-scale trials have been implemented on historically contaminated soils and model soils (ad hoc contamination) applying different white-rot fungi, alone or in combination with mobilizing agents. VII Combined use of white-rot fungi and mobilizing agents for the remediation of a model soil artificially contaminated with PAHs: Bioremediation efficacy by microorganisms is strongly affected by the low water solubility and bioavailability of PAHs and so the use of additives capable of mobilizing these contaminants from the soil organic phase to the aqueous one has been shown to positively influence their degradation. The first part of this thesis work was thus aimed to evaluate the effect of mobilizing agents (MA) on mycoremediation efficiency and to better understand the impact of this remediation strategy on the composition and diversity of the indigenous bacterial community. The study was conducted in a model system where a pristine soil was spiked with a mixture of seven PAHs (50 mg/g each of phenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, chrysene, benzo[k]fluoranthene and benzo[a]pyrene), to simulate a recent contamination, and subsequently incubated with white-rot fungi (Irpex lacteus 617/93, Pleurotus ostreatus 3004, Allescheriella sp. DABAC 1 and Phlebia sp. DABAC 9) and/or mobilizing agents, namely two polyoxyethylenepolysorbates (Tween-20 and Tween-80), a plant seed oil characterized by high concentration of polyunsaturated fatty acid (soybean oil, SO), olive-oil mill wastewaters (OMW) and randomly methylated -cyclodextrins (RAMEB). In the first part of this study Phlebia sp. and Allescheriella sp. have been used with or without the addition of Tween 20, Tween 80 and SO. The two fungal strains markedly differ for their growth capabilities under non-sterile conditions and without MAs (3.0 vs. 0.1 μg ergosterol g-1 soil, for Phlebia sp. and Allescheriella sp., respectively). However, SO led to a 35-fold increase of Allescheriella sp. growth. Contaminant degradations by Phlebia sp. and Allescheriella sp. were best supported by SO and Tween 20, respectively. Interestingly, the highest level of soil detoxification, as evaluated by assessing dehydrogenase activity, was reached following incubation with Allescheriella sp. without the addition of any MA. In accordance with these findings, enumeration of cultivable bacteria and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of PCR-amplified 16S rRNA showed that microbial growth and biodiversity were positively affected by remediation with white-rot fungi, and especially when Allescheriella sp. was used. In the second part of the study two white-rot fungi, namely Irpex lacteus and Pleurotus ostreatus, were tested alone or in combination with five MAs (Tween-20, Tween-80, SO, OMW, and RAMEB). Among the different MAs, SO best supported fungal growth and positively affected PAH degradation and soil detoxification but, VIII interestingly, showed a negative effect on both bacterial biomass and biodiversity when either one of the two fungi was used. It is worth noticing that even if both fungi showed a general decrease of the total weight of contaminants and an increase of soil detoxification in combinations with all MAs, their impact on endogenous bacteria was different. Indeed, when the soil was incubated with P. ostreatus bacterial biodiversity decreased and the type of MA used did not significantly affect the composition of the indigenous microflora. By contrast, when I. lacteus was used as inoculum, the diversity of the bacterial community increased and its structure was influenced by the type of MA used. Finally, cloning-sequencing of PCR-amplified 16S rRNA genes suggested the presence of well known PAH-degrading bacterial species belonging to the Bacillus e Burkholderia genera. Bioremediation of a historically contaminated soil with Botryosphaeria rhodina and Pleurotus pulmonarius: Two white-rot fungi, namely Botryosphaeria rhodina DABAC P82 and Pleurotus pulmonarius CBS 664.97 were tested for their ability to grow and to degrade aromatic hydrocarbons in an aged contaminated soil from the ACNA site (Cengio, SV, Italy), a former industrial area, decommissioned in 1994, where large-scale production of a wide array of organic chemicals had taken place for more than 100 years. The soil was characterized by the concomitant presence of both aromatic hydrocarbons, including chlorinated benzenes and anilines, thiophenes and polyaromatic hydrocarbons, and heavy metals (mainly Hg, Cu and As). Previous studies had demonstrated the unfeasibility of biostimulating the indigenous microflora to bioremediate this soil and thus mycoremediation with white-rot fungi was attempted. To evaluate the role of the indigenous microflora on the overall process, incubations were performed on both fumigated and non-fumigated soils. Fungal colonization by B. rhodina was unexpectedly lower in the fumigated than in the non-fumigated soil while the growth of P. pulmonarius showed an opposite response. Interestingly, degradation performances and detoxification by both fungi were markedly higher in the non-fumigated soil than those observed in the fumigated one suggesting an apparent synergistic effect occurring between the bioaugmented fungi and indigenous soil microflora. Heterotrophic bacterial counts in nonfumigated soil inoculated with either B. rhodina or P. pulmonarius were significantly higher than those of the corresponding incubation control. To evaluate the effects of fungal IX bioremediation on the bacterial community structure, numerical analysis of DGGE profiles of PCR-amplified 16S rRNA genes was performed. The bacterial community in the original non-amended ACNA soil was characterized by a low biodiversity. The amendment with sterilized maize stalks led to an augmentation of species richness and to marked changes in the community structure. Bioaugmentation with both fungi further increased the community diversity and resulted either in the appearance or in the enrichment of dominant hydrocarbon-degrading species as suggested by cloning and sequencing of 16S rRNA genes. Structural and functional modifications of the indigenous bacterial community during bioremediation of a historically contaminated soil with Panus tigrinus: Bioremediation of the aged contaminated soil ACNA was further investigated using the white-rot fungus Panus tigri