Plant systems for the production of viral antigens and as a source of immunogenic molecules

Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetaliIl presente lavoro di dottorato è stato realizzato con l’intento principale di impiegare i sistemi vegetali, quali piante di Nicotiana benthamiana e alga unicellulare Chlamydomonas reinhardtii, per l’espressione di antigeni di virus patogenici per l’uomo, al fine di sviluppare formulazioni vaccinali efficaci e/o test diagnostici specifici a basso costo. Inoltre in questo lavoro le piante sono state utilizzate come sorgente di molecole immunomodulatorie, in grado di potenziare le formulazioni vaccinali terapeutiche sviluppate nel nostro laboratorio. Rispetto ai sistemi convenzionali impiegati attualmente per la produzione di biofarmaceutici (batteri, lieviti, cellule di insetto e di mammifero in coltura), le piante offrono molteplici vantaggi. Oltre al fatto di essere organismi eucariotici in grado di dare origine a molecole con elevata autenticità strutturale (modificazioni post-traduzionali), alla capacità di crescere velocemente in condizioni di non-sterilità e a bassi costi, le piante rappresentano una piattaforma di produzione di biofarmaceutici sicura per l’uomo in quanto non contengono patogeni umani noti (prioni, virus, etc.). Una parte del presente lavoro ha riguardato la produzione in pianta di antigeni del SARS Coronavirus (SARS-CoV), agente eziologico della sindrome respiratoria acuta grave (SARS). La proteina del nucleocapside N (antigene d’elezione per lo sviluppo di saggi diagnostici sierologici della SARS) è stata prodotta in maniera transiente in N. benthamiana mediante infezione con un vettore derivante da un virus fitopatogeno (virus X della patata, PVX).e la sua specifica reattività/antigenicità è stata dimostrata mediante un saggio immunoenzimatico con sieri di pazienti cinesi affetti da SARS. Inoltre, mediante la tecnologia dell’agroinfiltrazione è stato possibile esprimere per la prima volta in pianta la glicoproteina transmembranaria M, un antigene del SARS-CoV meno caratterizzato degli altri in quanto difficile da produrre in sistemi ricombinanti. Le proteine N e M ottenute potrebbero essere impiegate per la formulazione di saggi diagnostici e vaccini contro il SARS-CoV. La seconda parte del lavoro si è incentrata sulla produzione in sistemi vegetali dell’oncoproteina E7 del virus del papilloma umano di tipo 16 (HPV-16), agenze eziologico di tumori principalmente a carico delle mucose genitali. Tale proteina è implicata nella trasformazione maligna delle cellule infettate e rappresenta l’antigene ideale per lo sviluppo di vaccini terapeutici per la cura delle lesioni pre- e cancerose indotte dal virus. In primo luogo si è scelto di esprimere la proteina E7 in N. benthamiana mediante agroinfiltrazione per cercare di incrementare le rese proteiche rispetto a quelle ottenute in precedenza nel nostro laboratorio mediante infezione con il vettore derivante dal PVX, al fine di purificare la proteina e caratterizzarla dal punto di vista biochimico. Tuttavia con questa tecnologia non c’è stato un miglioramento dei livelli di espressione per cui si è deciso di esprimere la proteina nella microalga Chlamydomonas reinhardtii. Oltre ad essere un organismo eucariotico che condivide con le piante numerosi vantaggi, questa microalga è in grado di crescere in condizioni di alto contenimento, risultando quindi più simile alle piattaforme impiegate attualmente per la produzione di biofarmaceutici e quindi più facilmente adattabile alle procedure di produzione secondo i criteri definiti “Good Manufacturing Practices” (GMP). Dopo alcuni tentativi di scarso successo di espressione della proteina E7 (nella forma mutagenizzata non oncogena E7GGG) mediante trasformazione nucleare, utilizzando anche ceppi migliorati per l’espressione, si è deciso di produrre la proteina E7GGG in cloroplasto. C. reinhardtii presenta un unico grande cloroplasto addossato alla membrana plasmatica, contenente circa 80 copie di genoma plastidiale. Tali caratteristiche rendono la trasformazione di questo organello molto più semplice e veloce rispetto alla trasformazione dei cloroplasti nelle piante superiori. A differenza della trasformazione nucleare, la trasformazione del cloroplasto ha permesso di esprimere la proteina E7GGG in Chlamydomonas in forma solubile. Questo rappresenta il primo caso di espressione di un antigene di HPV in una microalga. Questi risultati sono stati ottenuti impiegando il gene E7GGG con i codoni ottimizzati per l’espressione in cloroplasto e modificando il vettore per la trasformazione in modo da porre il gene E7GGG sotto il controllo di un promotore plastidiale forte. Nei prossimi mesi sarà analizzata l’attività biologica di questa proteina in un modello pre-clinico. L’ultima parte di questo lavoro di dottorato si è focalizzata sulla ricerca di nuove molecole con proprietà immunomodulatorie appartenenti al regno vegetale in grado di potenziare le formulazioni vaccinali terapeutiche basate sulla proteina E7 di HPV-16. Si è scelto di produrre una proteina di fusione costituita dalla proteina E7GGG e la saporina, un enzima prodotto dalla pianta Saponaria officinalis, appartenente alla famiglia delle “Ribosome Inactivating Proteins” (RIP), in grado di bloccare la sintesi proteica di procarioti ed eucarioti. Questa proteina è estremamente immunogenica nell’uomo ed è in grado di modulare anche risposte immunitarie aspecifiche, vantaggiose nella terapia dei tumori. Non essendo interessati alla tossicità della saporina abbiamo usato una forma mutagenizzata a livello del sito catalitico, ma che mantiene potenzialmente intatte le proprietà immunostimolatorie (mutante SAPKQ). L’inibizione della tossicità nel mutante SAPKQ è stata verificata in E. coli e in cellule di mammifero. Sono state realizzate fusioni tra il gene SAPKQ e il gene E7GGG, che differiscono per la presenza o assenza della sequenza segnale della saporina e per l’orientamento dei geni nella fusione (ssSAPKQ-E7GGG, SAPKQ-E7GGG ed E7GGG-SAPKQ), con il fine ultimo di formulare vaccini a subunità proteici (prodotti principalmente in pianta ma anche in E. coli) e vaccini genetici. Le tre diverse forme proteiche di fusione sono state espresse in cellule di E. coli, accumulandosi maggiormente nella frazione cellulare insolubile. In pianta, mediante l’uso del vettore derivante dal PVX, le proteine di fusione sono state prodotte a bassi livelli nella frazione insolubile cellulare. A differenza di E. coli, in questo sistema la sequenza segnale della saporina sembrerebbe essere riconosciuta, ma la proteina di fusione espressa presenta un peso molecolare inferiore all’atteso. Le basse rese ottenute e la necessità di chiarire questioni legate al processamento/degradazione delle proteine di fusione in pianta, non hanno per il momento consentito di valutare le risposte immunitarie in modello pre-clinico, ma nei prossimi mesi tali valutazioni saranno effettuate con le proteine di fusione purificate da E. coli. Anche per ottenere più rapidamente una prova di concetto riguardante la validità immunologica delle fusioni realizzate, sono stati elaborati vaccini a DNA. In seguito a verifica dell’espressione delle proteine di fusione in cellule di mammifero in coltura, i costrutti contenenti i geni di fusione sono stati utilizzati per la vaccinazione di un modello murino in grado di sviluppare tumore quando inoculato con una linea cellulare tumorigenica esprimente l’oncoproteina E7. I risultati ottenuti indicano che tramite la fusione del gene E7GGG con la saporina mutagenizzata è possibile ottenere in vivo un antigene maggiormente “visibile” al sistema immunitario rispetto all’antigene E7GGG, in grado di indurre una maggiore produzione di IgG totali anti-E7 e, soprattutto, una maggiore stimolazione di cloni linfocitari T E7-specifici, superando il problema della scarsa immunogenicità dell’antigene di per sé. Inoltre, rispetto al solo gene E7GGG, la fusione del gene E7GGG con la saporina mutagenizzata è in grado di proteggere più efficacemente dallo sviluppo del tumore gli animali sfidati con cellule tumorigeniche.This PhD work has been focused on the use of plant systems, as Nicotiana benthamiana plants and the unicellular alga Chlamydomonas reinhardtii, for the production of human pathogenic viral antigens, to develop effective vaccines and/or specific and low-cost diagnostic assays. Moreover, in this work plants have been used as a source of immunogenic molecules, able to improve therapeutic vaccine formulations developed in our laboratory. Compared to conventional systems (bacteria, yeasts, insect and mammalian cells) actually employed for biopharmaceuticals production, plant systems offer several advantages. They are eukaryotic organisms able to generate molecules with post-translational modifications, they can grow fast, at low costs, in non-sterile conditions, and they represent a safe platform for the production of human pharmaceuticals as they don’t contain human pathogens (e.i. prions, viruses, etc.). In the first part of this work we used plants for the production of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV) antigens. By the use of a viral vector derived from the potato virus X (PVX), we produce transiently in N. benthamiana plants the best candidate for the development of SARS serological diagnostic assays, the nucleocapsid protein (N). We demonstrated its specific reactivity/antigenicity with SARS patient sera by an immunoenzymatic assay. In addition, we were able to produce for the first time in plant the transmembrane glycoprotein (M) by agroinfiltration. Compared to other SARS-CoV antigens, this protein is less characterized because of the difficulty to produce it in a recombinant form. Both N and M proteins obtained in plant could be employed to formulate SARS diagnostic assay and vaccines. The second part of the work has been focused on the use of plant systems for the production of the Human Papilloma Virus type 16 (HPV-16) E7 oncoprotein. HPV-16 is the aetiological agent of cervical cancer and other tumours and the E7 protein, being involved in malignant cellular transformation, represents the ideal antigen for the development of therapeutic vaccines. Firstly we chose to express this antigen in N. benthamiana by agroinfiltration, trying to increase protein yield, compared to those previously obtained in our laboratory by infection with PVX vector, in order to purify the protein and characterize its biochemical properties. Unfortunately, the agroinfiltration technology didn’t allow the increase of the E7 protein yield, thereby we decide to express the protein in C. reinhardtii. This eukaryotic microalga shares with plants several advantages; in addition this organism is able to grow in contained conditions. This feature make this system similar to those currently used for pharmaceuticals production, hence more conformable to Good Manufacturing Practices (GMP) procedures, compared to plants. After failure attempts of the E7 protein expression (in the mutagenized non oncogenic form E7GGG) in C. reinhardtii by nuclear transformation, also using mutated strains improved for eterologous protein expression, we decide to produce the protein in the chloroplast. Presenting a unique large chloroplast that contain about 80 genome copies, plastid transformation of C. reinhardtii is simpler and faster than plant chloroplasts transformation. Unlike nuclear transformation, this technology allowed the E7GGG protein expression in a soluble form, representing the first example of HPV antigen production in microalga. This result has been obtained using a codon-optimized E7GGG gene and modifying the transformation vector in order to place the gene under the control of a strong promoter. In the next months we will analyze in a preclinical model the biological activity of the microalga produced E7GGG protein. In the last part of this work we focused our attention on the plant kingdom for the research of new immunomodulatory molecules, able to increase the effectiveness of therapeutic HPV-16 E7 based vaccines. We decided to formulate vaccines based on the fusion between the E7GGG protein and the saporin protein. Saporin is an enzyme from the plant Saponaria officinalis that belongs to the Ribosome Inactivating Proteins (RIP) family, able to inhibit protein synthesis in both prokaryotic and eukaryotic cells. This protein is highly immunogenic in humans and it is also able to modulate non-specific immune responses, important for cancer therapy. As we were not interested to saporin toxicity, we used a mutagenized form in the catalytic site (SAPKQ mutant), that could preserve the immunological properties. The toxicity abolition of the SAPKQ mutant was verified in E. coli and mammalian cells. We realized E7GGG/SAPKQ fusion proteins that differ for the presence or absence of the saporin signal sequence and for genes orientation in the fusion (ssSAPKQ-E7GGG, SAPKQ-E7GGG, and E7GGG-SAPKQ), with the purpose of develop protein subunit vaccines (firstly produced in plant, but also produced in E. coli) and genetic vaccines. The three different fusion proteins were expressed in E. coli, mainly in the insoluble cellular fraction. The same proteins were obtained by PVX infection in N. benthamiana plants, but at low levels and in the insoluble fraction. Unlike E. coli, in plant cells the saporin signal sequence was recognized, but the molecular weight of the processed protein is lower than expected. Because of low protein yields and because of necessity to clarify mechanisms involved in protein processing/degradation, it was not possible to perform vaccination experiments to evaluate the eventually increased immunogenicity of the plant produced vaccines. Nevertheless, in the next months we will be able to perform this analysis with the E. coli produced and purified fusion proteins. Also to obtain a rapid proof of concept concerning the immunological validity of vaccines based on the fusion proteins, we elaborated DNA vaccines. After tested the fusion protein expression in mammalian cells, we used DNA constructs to vaccinate mice that, subsequently to the inoculation of tumorigenic cancer cell line expressing the E7 protein, are able to develop cancer. Immunological results indicated that by fusion of the E7GGG gene with the mutagenized saporin it is possible to obtain in vivo an antigen able to induce a major production of total anti-E7 IgG and, more important, a major E7-specific linfocytes stimulation, than the E7GGG alone, that permit to overtake the poor immunogenicity of the E7 antigen per se. Moreover, compared to the E7GGG gene alone, the fusion proteins are able to protect more effectively from the tumour development challenged mice with tumorigenic cell line