Planning control stategies of the mosquito Ochlerotatus caspius in Northern Italy through a molecular-genetic approach

Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologicheOchlerotatus caspius è una zanzara di rilevante importanza sanitaria ed economica nei Paesi del Mediterraneo quali Spagna, Francia e Italia dove essa è ampiamente diffusa. A causa della sua spiccata aggressività nei confronti dell’uomo, tale specie riduce notevolmente la vivibilità delle aree soggette ad infestazioni ed è diventata una delle principali specie di zanzara oggetto di azioni di controllo da parte delle Autorità locali. In Italia, il costo dei programmi di controllo nell’area del delta del Po, della pianura Padana in Veneto ed Emilia e delle risaie della Lombardia e Piemonte è stato stimato nel solo 2004 intorno ai 10 milioni di euro. In Nord Italia Oc. caspius è diffusa sia nelle aree costiere sia nell’entroterra dove le risaie costituiscono un sito di riproduzione ottimale. Obiettivo generale del presente studio è stato quello di studiare alcuni aspetti della biologia, genetica ed ecologia di Oc. caspius in pianura Padana, al fine di fornire indicazioni per la pianificazione di strategie di controllo a basso impatto ambientale. La prima parte della ricerca ha riguardato lo studio della struttura e diversità genetica di popolazioni di Oc. caspius dell’Italia settentrionale attraverso l’uso di marcatori genetici sia nucleari (13 sistemi gene-enzima) che mitocondriali (sequenziamento di parte del gene codificante per la citocromo ossidasi 2). I risultati ottenuti suggeriscono che il pattern di migrazione tra le popolazioni di Oc. caspius in tale area sembra essere sufficientemente elevato da mantenere un’ampia omogeneità genetica. Inoltre, sono stati evidenziati i segni di una recente espansione demografica in alcune popolazioni. probabilmente legata alle moderne tecniche agronomiche adottate in risaia (incremento del numero di cicli di asciutta/allagamento delle stanze) e all’aumento in superficie delle risaie stesse nella pianura del Po. Quindi, efficaci programmi di controllo dovrebbero: i) essere principalmente focalizzati nelle risaie quali siti di riproduzione; ii) favorire tecniche agronomiche che riducono il numero di cicli di asciutta/allagamento; iii) essere condotti su ampia scala geografica; iv) monitorare periodicamente la suscettibilità delle popolazioni ai composti usati nelle campagne di controllo e adottare strategie tese ad evitare la possibile diffusione di alleli conferenti la resistenza. Un secondo punto affrontato nella presente ricerca ha riguardato lo studio in Oc. caspius della possibile esistenza di un meccanismo di difesa contro gli insetticidi legato a trasportatori di membrana denominati P-glicoproteine (P-gp) o trasportatori multidrug. Le P-gp sono ampiamente diffuse nel mondo vivente, dai batteri all’uomo, e costituiscono un sistema apparentemente capace di proteggere le cellule sensibili, i tessuti e quindi gli organismi da un ampio spettro di composti chimici citotossici diversi chimicamente e strutturalmente. Sono considerate la prima linea di difesa della cellula e un’amplificazione della loro attività di trasporto ha come conseguenza l’insorgenza della resistenza multidrug (resistenza MDR). L’obiettivo della ricerca è stato quello di esaminare il possibile ruolo delle P-gp in Oc. caspius nella difesa contro insetticidi temephos, ivermectina e diflubenzuron e di isolare sequenze di DNA codificanti per trasportatori P-gp. Sono stati realizzati biosaggi in cui larve di Oc. caspius erano trattate con i soli insetticidi e con gli insetticidi più verapamil, un inibitore dell’attività delle P-gp. L’inibizione delle P-gp ha ridotto i valori di LD50 di temephos e diflubenzuron rispettivamente di un fattore 3.5 e 16.4, suggerendo il potenziale coinvolgimento delle P-gp nella difesa a tali insetticidi. Utilizzando un approccio basato sulla Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) è stata isolata una sequenza di 476 paia di basi la cui sequenza aminoacidica inferita mostra un’alta omologia con la sequenza C-terminale di P-gp note. L’esistenza di un meccanismo, quale è quello legato all’attività delle P-gp, che protegge le cellule da un ampio spettro di composti insetticidi in condizioni normali, potrebbe essere selezionato come sito per la resistenza, provocando come conseguenza un notevole impatto negativo sulle attuali strategie di lotta. Al contrario, tuttavia, esso rappresenterebbe un sito su cui potenzialmente poter intervenire per aumentare l’efficacia dei trattamenti. L’inibizione di tale meccanismo di difesa, aumenterebbe infatti la suscettibilità degli individui agli insetticidi utilizzati per il controllo, consentendo così un loro minor impiego con conseguente diminuzione dell’impatto sull’ambiente. L’isolamento e la preliminare caratterizzazione di una sequenza genomica codificante per una P-glicoproteina in Oc. caspius, condotta in questo studio, è il primo passo per una maggiore comprensione del ruolo giocato dai trasportatori multidrug nella difesa in questa specie contro gli insetticidi ed apre la porta per la realizzazione di una nuova strategia di controllo basata sull’inibizione delle difese della specie target.Ochlerotatus caspius is a mosquito of great public health and economic impact in Mediterranean countries such as Spain, France, Italy and Greece where it is widely spread. Given its marked anthropophily, it significantly impairs the liveability of large areas and has thus become a major target of mosquito control programs implemented by local authorities. The total yearly cost of control programs in the Po Delta area, Po plain in the Veneto and Emilia regions and rice-growing areas in Lombardy and Piedmont was estimated in about 10 million euros in 2004. In Northern Italy Oc. caspius is widespread both in the coastal plain and inland, where rice fields constitute optimal breeding sites. The overall objective of this study was to improve our knowledge of the biology, genetic and ecology of Oc. caspius in the Po plain area in order to planning optimal control strategies of this mosquito species. Firstly, we used both mitochondrial and nuclear markers to investigate the population genetic structure and diversity of Oc. caspius. Our results suggested that the migration pattern among populations of Oc. caspius in Northern Italy appears to be high enough to maintain an extensive genetic homogeneity. At a local geographical scale, evidence of a recent population size growth was found in several populations. The increased availability of large breeding sites recently offered by rice paddies seem to have played a major role in giving rise to the observed demographic expansions. Indeed, these sites have become more numerous and undergone changes in the management technique (increased number of dry/flood cycles), which enhanced their suitability as breeding habitats. Therefore, satisfactory control programmes should: i) be mainly focused on rice paddies as breeding habitats, ii) favour agronomical techniques involving a reduced number of dry/flood cycles, iii) be carried out on a wide (regional) geographical scale, iv) periodically monitor the susceptibility of populations to the compounds used in control campaigns and adopt strategies aimed to avoid the possible spread of resistance alleles. In the second part of this research we studied in Oc. caspius the possible existence of a defence mechanism against insecticides due to P-glycoproteins (P-gps) efflux transporters or multidrug transporters. P-gps are cell membrane transporters and are found in all living cells protecting them from multiple structurally dissimilar toxic compounds. Their action consist in transporting toxic substances outside the cell, reducing the concentration inside cells as much as possible. The purpose of this study was to examine in the mosquito Oc. caspius the possible role of P-gps in the defence against insecticides temephos, ivermectin and diflubenzuron and to isolate genomic DNA sequences encoding for P-gp transporters. Mosquito larvae were treated with insecticides alone and in conjunction with a sublethal dose of P-gp inhibitor verapamil. The inhibition of P-gps reduced the LD50 values of temephos and diflubenzuron by a factor of 3.5 and 16.4 respectively, suggesting the potential involvement of P-gps in insecticide defence. Using a polymerase chain reaction (PCR)-based approach, a 476-base-pair sequence was isolated, whose inferred aminoacidic sequence shows high homology with the C-terminal sequence of known P-gps. The existence of such a mechanism protecting insects from a broad spectrum of chemical products and thus the possibility that other sites are involved in endowing them with resistance poses an additional challenge to pest control planners. However, identifying P-gp sites with the ultimate aim of inhibiting them could represent a new control strategy. By increasing the susceptibility of organisms to insecticides, it would be possible to reduce their doses and frequency of application. The isolation and preliminary characterization of a P-gp putative sequence from Oc. caspius is the first approach to a better molecular understanding of the role played by multidrug transporters in the defence of this species against insecticides, which could open the way to novel control strategies based on the inhibition of pest defences