Theoretical studies to elucidate reversible inhibition by covalent inhibitors of the enzymes Golgi-alpha-mannosidase and rhodesain

Die Entwicklung maßgeschneiderter Proteinliganden ist ein integraler Bestandteil unterschiedlicher wissenschaftlicher Disziplinen, wie z.B. Wirkstoffentwicklung. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der reversiblen Inhibition in Form von kovalent gebundenen Enzym-Inhibitor-Komplexen der humanen Golgi-alpha-Mannosidase II (GM II) und der Cysteinprotease Rhodesain. Beide Enzyme sind erfolgversprechende Targets in der Bekämpfung von zwei sehr unterschiedlichen Erkrankungen. Einerseits die Golgi-alpha-Mannosidase bei der Behandlung der Tumorprogression und andererseits die Cysteinprotease Rhodesain bei der Behandlung der Afrikanischen Schlafkrankheit. Die Arbeit an den zwei Enzymen unterteilt sich in zwei Teilprojekte. Die Entwicklung von maßgeschneiderten kovalent-reversiblen Inhibitoren für die genannten Enzyme wurde im Rahmen eines in-house entwickeltes Protokolls zwecks des rationalen Designs kovalenter Inhibitoren, durchgeführt. Dieses Protokoll basiert auf einer sich gegenseitig unterstützenden Zusammenarbeit zwischen Theorie und Experiment. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den theoretischen Untersuchungen mit Hilfe der quantenmechanischen (QM) als auch mit Hilfe der kombinierten quantenmechanisch/molekülmechanischen (QM/MM) Methoden zu den genannten Enzymen. In einem ersten Schritt des Protokolls geht es um die Anwendung von Screeningverfahren. In einem Screening werden Leitstrukturen, zunächst in Lösung (Schritt I), für eine weitere Untersuchung im Enzym (Schritt II) evaluiert. So können die Inhibitoren, für die experimentelle Mess- oder theoretische Dockingdaten vorhanden sind, als eine Leitstruktur betrachtet werden. Durch das Screening unter Verwendung der quantenmechanischen (QM-Modell) Methode kann eine Reihe von Inhibitoren nach einem sich konsistent veränderndem Muster erstellt werden und auf Bindungsparameter hin untersucht werden (Schritt I). Diese Parameter sind Reaktionsenergien und Höhen der Reaktionsbarriere einer Inhibitionsreaktion. Reaktionsenergien werden in dieser Betrachtung quantenmechanisch innerhalb der Born-Oppenheimer-(BO)-Näherung und im Rahmen des Konzeptes der Potentialhyperflächen (PES) als relative Energien zwischen den optimierten Geometrien der Produkte und der Edukte auf einer Potentialhyperfläche für die Inhibitionsreaktion ermittelt. Die Höhen der Reaktionsbarrieren werden durch die relativen Energien zwischen den Geometrien der Edukte und der Zwischenstufen oder Übergangszustände abgeschätzt. Unter Inhibitionsreaktion wird eine chemische Reaktion verstanden, bei der eine kovalente Bindung zwischen dem Inhibitormolekül und den Aminosäuren in der aktiven Tasche eines Enzyms ausgebildet wird. Für den Schritt I werden die Aminosäuren der aktiven Tasche durch kleine Moleküle, wie Essigsäure und Methanthiol, angenähert. Die kovalent-reversiblen Inhibitoren sollten in dieser Betrachtung nur leicht exotherme Reaktionen mit den relativen Energien im Bereich -5 bis -10 kcal/mol aufweisen. Der experimentelle Teil liefert währenddessen die Synthese der neuen Inhibitoren und die Nachweise zur kovalenten Bindung mit Hilfe massenspektrometrischer Messungen (Schritt I). Die passenden Kandidaten aus dem ersten Schritt des Protokolls, d.h. Inhibitoren mit gewünschten Bindungsparametern, werden durch die QM/MM-Berechnungen im Enzym (Schritt II) und durch die experimentellen Messungen an den Enzym-Inhibitor-Komplexen in Assays (Schritt II) analysiert. Die Untersuchungen für die Stufe II des Protokolls umfassen die Berechnungen der Reaktionsprofile und Minimumenergiereaktionspfade für die chemischen Reaktionen von Inhibitoren im Zielenzym. Ein Pfad minimaler potentieller Energie, der zwei Minima (hier Edukt und Produkt) verbindet, stellt ein Reaktionsprofil für eine chemische Reaktion dar. In der vorliegenden Arbeit wird dies auch als Minimumenergiepfad (MEP) bezeichnet. Der Letztere lässt sich durch die Nudged Elastic Band (NEB)-Methode und mittels Potentialhyperflächen darstellen. Die Reversibilität der Inhibitoren wurde anhand der berechneten chemischen Reaktionen in Form von erstellten Reaktionsprofilen analysiert und diskutiert. Durch Protein-Ligand Docking (Schritt III) wird ein Screening von variierbaren Erkennungseinheiten der neuen Inhibitoren durchgeführt. Die Ergebnisse der Untersuchungen aus dem dritten Schritt liefern Hinweise zur Weiterentwicklung der ausgewählten Inhibitoren. Die letzte Stufe des in-house Protokolls besteht in der erneuten Untersuchung der optimierten Inhibitoren mit Hilfe von Theorie und Experiment (Schritt IV). Die theoretische Untersuchung anhand von QM/MM-Berechnungen überprüft, ob die Inhibitionsreaktion der reaktiven Kopfgruppe nach der Änderung der Erkennungseinheit des Inhibitors weiterhin effektiv und nach dem gleichen Mechanismus mit der aktiven Seite des Enzyms ablaufen kann. Die experimentelle Untersuchung liefert, ähnlich wie im Schritt II, die messbaren Ergebnisse der Inhibition in Hinblick auf die Bindungseigenschaften und die Entstehung der Nebenprodukte. Die Untersuchungen am System Mannosidase GM II wurden in Zusammenarbeit mit den Arbeitskreisen von Prof.Dr. J. Seibel und Prof.Dr. T. Schirmeister durchgeführt. Die Leitstruktur zur Entwicklung des kovalent-reversiblen Inhibitors stellt der cyclische O,O-Acetal-Inhibitor (bestimmt anhand von Dockingexperimenten an der beta-L-Anhydrogulose durch Arbeitskreis Prof.Dr. J. Seibel) dar. Die Ergebnisse der theoretischen Studie liefern für den ersten Schritt im Rahmen des Protokolls den geeigneten Kandidaten aus einer Menge von insgesamt 22 modellierten Inhibitoren für die reversible Inhibition der Mannosidase GM II durch die Ausbildung einer kovalenten Bindung. Hierzu zählen zunächst die thermodynamischen Modellberechnungen der Inhibitionsreaktion, welche die Reaktionsenergien für alle Kandidaten des Screenings liefern. Die Inhibitionsreaktion wird in diesem Schritt als Additionsreaktion von Essigsäure an den Inhibitor-Kandidaten modelliert. Für die Leitstruktur resultiert eine thermoneutrale Beschreibung der Reaktion mit Essigsäure und dient im Weiteren als Referenz. Der Inhibitor Nr.7 (der cyclische N,O-Acetal-Inhibitor) zeigt mit -7,7 kcal/mol eine leicht exotherme Reaktion und somit eine bessere Triebkraft der untersuchten Reaktion im Vergleich zur Referenz. Die beiden Inhibitoren wurden dann für Stufe 2 des Protokolls untersucht, in der eine Analyse der Reaktionsprofile im Enzym mit Hilfe der QM/MM-Methodik durchgeführt wurde. Die Ergebnisse des zweiten Teils der Studie zeigen, dass der cyclische N,O-Acetal-Inhibitor eine deutlich bessere Affinität zur aktiven Seite der GM II im Vergleich zu seiner Leitstruktur aufweisen sollte. Dies zeigt sich auch in der deutlich höheren Triebkraft der Inhibitionsreaktion von ca. -13 kcal/mol. Dieser Energiebeitrag ist klein genug, um eine Reversibilität der Inhibitionsreaktion gewährleisten zu können. Das bedeutet auch, dass der N,O-Acetal-Inhibitor im Vergleich zur Referenzstruktur eine deutlich stärkere Inhibition bedingen sollte. Berücksichtigt man dann noch, dass die Reaktion laut Berechnungen nur leicht exotherm sein sollte, erhält man die Möglichkeit einer reversibel stattfinden kovalenten Hemmung. Zusammenfassend liefert dieser Teil der Arbeit, der mit Hilfe der QM- und QM/MM-Berechnungen durchgeführt wurde, ein reaktives molekulares Gerüst mit den gewünschten Eigenschaften. Durch die theoretischen Untersuchungen (MD-Simulationen am Enzym-Inhibitor-Komplex) konnte außerdem eine zur Komplexbildung geeignete Konformation der Leitstruktur sowie des neuen Inhibitors gefunden werden. Die reversibel agierenden Acetal-Inhibitoren befinden sich in der aktiven Tasche in einer energetisch höher liegenden Twist-Boot-Konformation und begünstigen mit zwei entstehenden Bindungen zum Zn2+-Ion die oktaedrische Koordination im Enzym. Als Teil dieser Arbeit wurden NEB-Berechnungen zur Bestimmung von Minimumenergiepfadendurchgeführt. Dies lieferte erweiterte Einblicke in der Berechnung von Reaktionsmechanismen jeweils auch in Kombination von 2- bzw. 3-dimensionalen Scans. Auch in der Beschreibung von Protonenübertragungsreaktionen nach Grotthus, die einem Umklappen der kovalenten Bindungen entsprechen, erhält man hier Geometrien für die Teilschritte und somit eine detaillierte Beschreibung des Vorgangs. Der Mechanismus der Inhibition von GM II durch die Leitstruktur beinhaltet einen Wasser-katalysierten (oder auch Wasser-vermittelten) Ringöffnungsschritt in der Tasche des Enzyms. Die Testrechnungen zum Protontransfer haben gezeigt, dass der Protontransfer über ein oder mehrere Wassermoleküle unter Verwendung von Standard-PES-Berechnungen nicht spontan stattfindet. Die Berechnung des MEP durch das Erstellen einer 3-dimensionalen Potentialhyperfläche kann nur dann sinnvolle Ergebnisse liefern, wenn der Protontransfer vom Aspartat Asp341 zum Inhibitor über zwei Wassermoleküle explizit berücksichtigt wird. In diesem Fall ist die Berechnung der PES kein Standard und erfordert eine zusätzliche Variation der Bindungsabstände O-H der beteiligten Moleküle des Protontransfers. Die Details für die zusätzliche Variation der Bindungsabstände O-H bei der Berechnung der 3-dimensionalen PES haben die NEB-Berechnungen geliefert. Der NEB-Formalismus hat sich in der Beschreibung dieser komplexen Reaktionskoordinaten als besser geeignet erwiesen und wurde in dieser Arbeit aus diesem Grund hauptsächlich verwendet. Die Berechnung des Protonentransfers während einer Hemmungsreaktion durch zwei Wassermoleküle mit der NEB-Methode hat den MEP ermittelt, welcher zunächst nicht auf der Grundlage eines 3-dimensionalen Scans ermittelt werden konnte. Solche QM/MM-Rechnungen wurden im Rahmen des in-house Protokolls zum ersten Mal durchgeführt. Dieser Protontransfer ist mit dem Grotthus-Mechanismus konform und kann plausibel anhand einer Klapp-Mechanismus-Betrachtung nachvollzogen werden. Mit Hilfe der NEB-Methode ist es möglich MEPs effektiv und relativ schnell zu ermitteln. Es werden sowohl die Geometrien entlang des Pfades wie auch die einzelnen relativen Energien erhalten. Zur Überprüfung der gefundenen Übergangszustände wurden die einzelnen Strukturen mit Hilfe der Normalmodenanalyse weiter untersucht und konnten verifiziert werden. Die MEP-Berechnungen für den Inhibitor Nr.1 ermöglichen die Etablierung eines Protokolls zur Berechnung eines Reaktionspfades über mehrere Moleküle, welches anschließend zur Berechnung des MEP für den Inhibitor Nr.7 angewendet wird. Das Protokoll beinhaltet in seiner einfachen Form die Ermittlung der Two-End-Komponenten einer chemischen Reaktion - Geometrien von Reaktant und Produkt. Betrifft dies eine Reaktion, die über mehrere Moleküle, z.B. Wassermoleküle oder deren Netzwerk, stattfindet, wird die Aufgabe komplexer. In diesem Fall ist eine Berechnung mit Hilfe des NEB-Moduls wesentlich produktiver als die Charakterisierung mit Hilfe der 3-dimensionalen PES. Der Vorteil liegt in der kollektiven Beschreibung der Reaktionskoordinaten, sodass die entscheidenden Reaktionskoordinaten und Variablen für die Durchführung von Scans nicht einzeln bestimmt werden müssen. Dennoch kann es hier bei komplexen Reaktionskoordinaten auch zu Konvergenzproblemen bzw. zu langwierigen Optimierungszyklen kommen. Als weiteres Resultat liefern die durchgeführten MEP-Berechnungen Einblicke in die katalytischen Eigenschaften der Wassermoleküle für den Protonübertragungsmechanismus nach Grotthus. Die Daten zeigen, dass die Barriere am niedrigsten wird, wenn zwei Wassermoleküle beim Protontransfer beteiligt sind. Wenn nur ein oder gar kein Wassermolekül die Ringöffnung katalysiert, steigt die Barriere auf 12 und 17 kcal/mol. Die Untersuchung in diesem Teil der Arbeit lässt zudem Einblicke in die nukleophile Substitution der Vollacetale in der Enzym-Tasche der GM II erlangen. Die Rechnungen deuten darauf hin, dass die Vollacetal-Inhibitoren durch Wassermoleküle in der Tasche aktiviert werden. Die ausgebildeten Wasserstoffbrückenbindungen begünstigen die Geometrie des Enzym-Inhibitor-Komplexes. Dies befördert die Ringöffnungreaktion gleichzeitig mit dem nucleophilen Angriff des Aspartatrestes an dem C1-Atom des Inhibitors. Im Falle des gemischten Acetal-Inhibitors hingegen wird die Treibkraft bereits durch die Einführung des Stickstoffatoms deutlich erhöht. Durch die richtig angeordneten Grotthus-Wassermoleküle ist in diesem Fall die Barriere der Protonübertragung durch das Aspartat-Aspartat-System der GM II (Asp341/Asp240) sekundär. Betrachtet man die Schwingungsbewegung entlang der imaginären Moden der Übergangszustände, sind diese in beiden E-I-Komplexen ähnlich. Hierbei wird eine synergistische Bewegung der Bindungsabstände OD2-C1-O6 (Inhibitor Nr.1) bzw. OD2-C1-N (Inhibitor Nr.7) beobachtet. Die Entwicklung der kovalent-reversiblen Inhibitoren für das Enzym Rhodesain wurde in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Prof.Dr. T. Schirmeister durchgeführt. Als Leitstruktur zur Entwicklung des neuen kovalent-reversiblen Vinylsulfon-Inhibitors 4-Pyridyl-Phenylalanyl-Homophenylalanyl-alpha-Fluor-Phenylvinylsulfon dient in diesem Projekt der kovalent-irreversibel bindende Inhibitor K777, für den kristallographische Daten bekannt sind. Im Rahmen des Protokolls wurde eine Reihe von Inhibitoren untersucht, in denen ein alpha-H-Atom der Vinylsulfon-Einheit (im Weiteren VS für Vinylsulfon) durch verschiedene Gruppen X substituiert wurde. Für den zunächst vorgeschlagenen Cyano-Substituent (CN) in einem VS-Inhibitor ergab sich bei Berechnungen in einem polaren Lösungsmittel eine relativ niedrige Reaktionsenergie, d.h. es wurde eine reversible Reaktion vorhergesagt. Dies wurde experimentell bestätigt. Die theoretischen und experimentellen Ergebnisse von Schritt II widersprechen sich aber. Während experimentell eine schwache reversible Hemmung gefunden wurde, sagten die Berechnungen keine Hemmung voraus. Tatsächlich zeigte sich im Nachhinein, dass die experimentell gefundene Hemmung nicht-kompetitiv ist, d.h. nicht in der aktiven Tasche stattfindet. Im Rahmen des Protokolls werden dagegen nur die kompetitiv interagierenden Inhibitoren ausgewertet. An dieser Stelle lassen sich die anhand theoretischen Methoden erhaltenen Daten über die Reversibilität der Hemmung (Reaktion im aktiven Zentrum) mit den Ergebnissen aus den experimentellen Untersuchungen (Reaktion außerhalb des aktiven Zentrums) nicht vergleichen. Durch den Wechsel von CN zu Halogenen wurde schließlich eine neue Reihe von Inhibitoren auf VS-Basis entwickelt. Die Berechnungen von Reaktionsenergien in Lösung und im Enzym haben für diese Inhibitoren eine reversible Hemmung vorhergesagt. Allerdings findet man eine einfache Additionsreaktion an der Doppelbindung der Vinylsulfon-Gruppe. Für X=CN wurde von einer SN2-Reaktion ausgegangen. Für X=Br fand man, dass sich nach der Addition ein HBr-Molekül abspaltet, sodass die Hemmung insgesamt irreversibel ist. Da die Substitutionsreaktion ein irreversibler Prozess ist und die Freisetzung von Bromwasserstoff durch die experimentellen Untersuchungen bestätigt werden konnte, scheint Fluor ein geeigneter Substituent zu sein (X=F). Hier konnte man auch experimentell eine deutlich bessere Hemmung messen. Es wurden daher die Berechnungen im Enzym für Systeme mit den Inhibitoren K777-X mit X=F und X=H (K777-F- und K777-H-Inhibitor) durchgeführt und analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, die Reversibilität des K777-F-Inhibitors gegen die Irreversibilität des K777-H-Inhibitors durch die quantenmechanischen Berechnungen im Rahmen des Protokolls darzulegen. Die QM/MM-Berechnungen unterteilen sich in zwei Bereiche. Zunächst wurde das Reaktionsprofil (auch Reaktionspfad) der Additionsreaktion des K777-X-Inhibitors an die aktive Tasche von Rhodesain ausgehend von der vorhandenen Kristallstruktur (PDB-Datei) berechnet. Im Folgenden wird dieses Teilergebnis als XP-Berechnung (im Weiteren XP für X-ray-Pfad) bezeichnet. Alle vier PES (X=H, F, Br und Cl) weisen prinzipiell die gleiche Form auf. Es ergeben sich aber Unterschiede in den berechneten Reaktionsenergien der Additionsreaktion (-20, -16, -10 und -11 kcal/mol). Die Reaktionsenergien der Substituenten Brom und Chlor entsprechen dem Bereich für reversible Reaktionen (ca. -10 kcal/mol), wobei Fluor mit -16 kcal/mol einen Grenzfall darstellt. Die Konturen der beiden PES (X=H vs. X=F) sind allerdings sehr ähnlich: In beiden Fällen findet sich für das anionische Intermediat kein Minimum. In der Potentialhyperfläche für X=F steigt die Barriere der Rückreaktion zwischen dem Intermediat und dem nicht-kovalenten Komplex auf etwa 5 kcal/mol an, die Rückreaktion ist im Vergleich zu dem X=H mit ca. 1,5 kcal/mol leicht exotherm. Das veränderte Verhältnis zwischen der Höhe der Reaktionsbarriere und dem Betrag der Reaktionsenergie (der Übergang von der endothermen zur exothermen Reaktion) auf diesem Abschnitt der PES könnte dazu beitragen, dass die Gesamtreaktion insgesamt reversibel ablaufen kann. Die Reversibilität des Inhibitors mit dem Substituenten Fluor lässt sich auf diesem Schritt der Untersuchung durch die Absenkung der Reaktionsenergie der Additionsreaktion auf etwa 16 kcal/mol erklären, denn die irreversible Reaktionen wurden bisher mit deutlich höheren Reaktionsenergien assoziiert. Die erhaltenen nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplexe der XP-Berechnungen wurden in einem zweiten Teilergebnis weiter verwendet, indem der Reaktionspfad der Additionsreaktion des K777-X-Inhibitors vom nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplex zum kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplex hin berechnet wurde. Im Folgenden wird dieses Teilergebnis als NP-Berechnung (NP für Nicht-kovalente-Pfad) bezeichnet. Die Berechnung der Reaktionsprofile der Additionsreaktion des VS-Inhibitors für X=H und X=F am alpha-Kohlenstoffatom der VS-Kopfgruppe lieferte konsistente Ergebnisse in Bezug auf die Reaktionsenergien. Ähnlich den XP-Berechnungen, wurde ebenfalls die Tendenz der Absenkung der Reaktionsenergie von -7 kcal/mol (X=H) auf -4,3 (X=F) und -0,9 kcal/mol (X=Br) beobachtet. Die Thermodynamik der Additionsreaktion wurde durch einen Wechsel des Substituenten X von H nach F in der VS-Kopfgruppe des K777-X Inhibitors beeinflusst, indem die niedrigere Energiedifferenz zwischen den Edukten und den Produkten erzielt werden konnte. Für beide Teile der Arbeit (XP- und NP-Berechnungen) implizierte dies einen Wechsel von einem irreversiblen zum einem reversiblen Verlauf in der Beschreibung der Reaktionsprofile. Die Ergebnisse des zweiten Teils der Arbeit (NP-Berechnungen) liefern nicht nur die konsistent geringeren Reaktionsenergien (Thermodynamik) sondern auch die höheren Reaktionsbarrieren der Additionsreaktion im Vergleich zu den Ergebnissen der XP-Berechnungen. Die Änderungen der Reaktionsbarrieren im NP-Ansatz weisen zusätzliche Diskrepanzen auf, wenn diese jeweils mittels der PES-Scan- und CI-NEB-Dimer-Methodik berechnet werden. Während die Barriere des irreversiblen Inhibitors K11777 mit dem NEB-Ansatz ca. 11 kcal/mol beträgt und durch den PES-Scan nur um 4 kcal/mol höher liegt, ergibt sich eine umgekehrte Situation beim Übergang zu Fluor als Substituent: Durch die NEB-Berechnung liegt die Barriere bei ca. 18 kcal/mol und durch den PES-Scan ergibt sich eine um 4 kcal/mol niedrig liegende Barriere. Um die Ergebnisse der NP-Berechnungen zu überprüfen, wurden diese QM/MM-Rechnungen wiederholt durchgeführt. In den beiden neu durchgeführten Berechnungen für die Inhibitoren K777-X mit X=H und X=F wurden nur sehr kleine Abweichungen gefunden, die kleiner als die Fehler der Berechnung sind. Die Startstrukturen für die Berechnung des MEP stammten aus der erneut durchgeführten MD-Simulation an der Geometrie des nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplexes, welche die XP-Berechnung resultierte. Die Gesamtdauer der MD-Simulation wurde zu einem Wert von 9 ns gewählt, welche insgesamt 900 Startstrukturen entlang der Simulation lieferte. Die Berechnung ergab die Reaktionsenergie von -8,4 kcal/mol (-7,0 kcal/mol als erstes Ergebnis) und die relative Energie des Int-Komplexes von 13,2 kcal/mol. Somit beträgt die Barriere der Rückreaktion zur Freisetzung des Inhibitors K11777 (X=H) in Form von einem nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplex einen Wert von 21,6 kcal/mol. In analoger Vorgehensweise wurde die Evaluierung der NP-Berechnung für den Inhibitor K777-X mit X=F durchgeführt. Die Reaktionsenergien in den beiden Berechnungen unterscheiden sich in einem marginalen Abstieg zu den Werten von -2,9 kcal/mol und -3,3 kcal/mol (-4,3 kcal/mol als erstes Ergebnis). Beide Berechnungen liefern zudem die relativ kleinen Anstiege der Reaktionsbarriere zu den Werten von 19,8 kcal/mol und 20,9 kcal/mol. Für die Inhibitoren K777-X mit X=H und X=F entsprechen die gefundenen Barrieren einer verzerrten Konformation des nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplexes, die als eine bioaktive Konformation bezeichnet werden kann. Der anionische Übergangszustand Int*, der oft in der Literatur als ein anionisches Intermediat der Additionsreaktion bezeichnet wird, wurde nur für den Inhibitor mit dem Substituenten Brom (K777-X mit X=Br) identifiziert. Da der Übergangszustand (Int* mit der relativen Energie von 11,1 kcal/mol) nur 1,5 kcal/mol über der bioaktiven Konformation (Int mit der relativen Energie von 12,6 kcal/mol) liegt und die NEB-Reaktionspfade alleine die Barrieren überschätzen, besitzen die anionischen Übergangszustände der Additionsreaktion der Inhibitoren mit X=H und X=F eine geschätzte relative Energie mit vergleichbaren Abweichungen von ca. 2 kcal/mol zu den identifizierten Int-Geometrien. Die durchgeführten Berechnungen zeigen, dass die Substituenten X=H und X=F im Vergleich zum Brom die anionischen Geometrien der nicht-kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplexe jedoch mangelhaft bis ausreichend stabilisieren können.