Welfare management practices in intensive fish farming

Fish welfare is a major priority for consumers besides producers, as there is a greater demand for safe and high-quality products from welfare-friendly farms. Stress, which is largely caused by the aquaculture practices applied in fish farms, contributes to the degradation of well-being. Over the past two decades, many studies have reported the beneficial use of medicinal plants in nutrition of several farm animal species and more recently the number of scientific studies has increased on the application of alternative additives in the production of fish in order to improve health and well-being. The purpose of this PhD thesis is to evaluate the effect of three medicinal plants (oregano essential oil Origanum vulgare, cinnamon essential oil Cinnamomun zeylanicum and industrial hemp seed oil Cannabis sativa), on growth, feed utilization and proximate composition as well as stress response caused by intense handling, starvation and high fish density. Formulation of diets included the partial and total replacement of soybean oil at a rate of 1% and 2% of the feed by the experimental phytopharmaceuticals. A total of four trials were conducted. In the 1st trial, fish were fed with the experimental diets for 74 days. Growth and proximate composition of the total body were evaluated. Health status of fish was also investigated through hematological parameters and level of stress was evaluated through blood cortisol levels and DNA damage in tissues. Also, histological analyses, fatty acid profile, brain neurotransmitters through predictive models and fish feeding behavior were investigated. The addition of hemp seed oil did not cause mortality and enhanced growth (no significant differences) while it caused no significant differences in proximate composition. The groups supplemented with essential oils of oregano and cinnamon showed reduced survival, with the groups fed 2% having the highest mortality rate. In groups supplemented with 1% oregano and cinnamon, no significant differences in growth were observed, while the groups with the addition of 2% showed significantly lower feed consumption, weight gain, specific growth rate (SGR) and lower food conversion ratio (FCR) and lipid retention (LR). Hepatosomatic index (HSI) and condition factor (K) did not show significant differences in any dietary group. Determination of the proximate composition of the 2% oregano and cinnamon groups showed a significant increase in protein, ash and energy in the total body of the fish, while fat was significantly lower. Haematological parameters determined (Ht, RBC, WBC and DLC) and plasma cortisol levels showed no significant differences in any dietary group, while DNA damage was higher for the OR1% group in hepatocytes and intestinal cells. Furthermore, the addition of hemp seed oil and cinnamon essential oil at a rate of 2% induced hepatic steatosis and cytoplasmic vacuolation, while no histomorphological changes and pathological findings were found in the foregut samples of all dietary treatments. Determination of the fatty acid profile showed that the experimental oils maintained the lipid composition and quality without particular changes. Determination of brain neurotransmitters based on predictive models showed no significant differences in the case of oregano and cinnamon essential oils, The determination of brain neurotransmitters based on predictive models showed no significant differences in the case of the addition of oregano and cinnamon essential oils to the fish feed, while the addition of hemp seed oil caused a significant increase in 5-HT concentration and a significant decrease in 5-HIAA in the CAN2% than CAN1% group. Also, DOPAC/DA ratio in medulla was found to be significantly greater in CAN1% and CIN2% groups than CAN2% and CIN1% groups, with no significant differences from the control group. Study of feeding behavior showed that the intense smell of essential oils of oregano and cinnamon was unpleasant for the fish. As a result, the food was consumed mainly from the bottom of the tank, while food containing hemp seed oil was consumed faster. In conclusion, the addition of essential oils of oregano (O.vulgare) and cinnamon (C.zeylanicum) are not suitable dietary additives for sea bream juveniles in this quantity (20gr/Kg) as they inhibit growth and cause significant increase in mortality rate. The addition of the tested essential oils at 1% needs further investigation. C.sativa hemp seed oil at 1% is recommended for use in sea bream juvenile’s feed as growth promoter. The 2nd trial aimed to investigate the effect of acute stress, induced by intense netting procedures for 5 min after feeding with the experimental diets for 84 days. Health status of fish was investigated through hematological parameters. Also, plasma cortisol levels and DNA damage in the liver and blood were evaluated. Determination of hematological parameters showed no significant differences in Ht, RBC and WBC in any dietary group, while a significantly increased number of lymphocytes and a significantly lower number of granulocytes were observed in the groups fed with oregano essential oil. Cortisol levels in plasma were found to be reduced after supplementation with hemp seed oil and cinnamon essential oil. DNA damage in hepatocytes was found to be extensive in all dietary groups except the 1% hemp seed oil group, while DNA damage in erythrocytes was significantly higher only in the 2% cinnamon essential oil group. In conclusion, hemp seed oil at a rate of 1% appeared to be the most effective as an anti-stress agent after submitting the fish to intense handling, however more studies need to be conducted on the effect of these medicinal plants on acute stress. The 3rd trial aimed to investigate the effect of starvation for 14 days after feeding with the experimental diets for 84 days. At the end of the experimental trial, health status of fish through hematological profile, plasma cortisol and DNA damage in the liver and blood were evaluated. Hematological parameters showed that between groups fed during the whole experiment and starved groups, there was a trend towards a decrease in RBC and WBC counts, with significant differences in the hemp and cinnamon groups, but no significant differences were observed from the control group that was fed normally during the whole experiment. Groups fed with oregano essential oil at 1% (OR1%) throughout the experiment but also those subjected to starvation had a significantly higher percentage of WBC than the corresponding control groups. Cortisol levels showed a significant decrease in plasma cortisol after starvation in all dietary groups except the group fed with 2% oregano essential oil. Lower DNA damage was also found in all groups fed with the tested phytopharmaceuticals, while no significant differences were seen in blood, except for the group fed 1% cinnamon essential oil, which significantly reduced genotoxicity. In conclusion, the addition of cinnamon essential oil at a rate of 1% appeared to be the most effective in the stress response after submitting the fish to prolonged starvation for 14 days. The 4th trial aimed to investigate the effect of phytogenic additives on stress response due to chronic stress caused by an increase in stocking density for two months. Two fish densities were applied: 1.2m3/Kg (low fish density) and 2m3/Kg (high fish density). At the end of the experimental procedure, health status of fish was investigated through hematological profile. Also, plasma cortisol levels and DNA damage in hepatocytes and erythrocytes were evaluated. Results showed that while there was a trend towards a decrease in WBC counts in the groups at high fish density, no significant differences were found with the control group that was fed throughout the experiment. Cortisol response was lower in all groups fed with phytopharmaceutical additives at a rate of 2% at high fish density, while high levels of cortisol were observed in all dietary groups at 1% supplementation at low and high fish density. The results showed that the addition of phytopharmaceuticals in feed at a rate of 1% was more effective compared to the addition at 2% in reducing DNA damage in hepatocytes at the high fish density, however only the hemp seed oil and essential oil of oregano fed groups at a rate of 1% had significantly lower values. No significant differences were observed in DNA damage in erythrocytes between the dietary and control groups at high and low fish density. In conclusion, we cannot say that any of the tested phytopharmaceutical additives were completely effective in reducing stress response induced by chronic stress due to high fish density for 2 months, however, further investigation is needed. Lastly, a protocol was created to evaluate the well-being of fish during intensive fish farming. As a general conclusion, hemp seed oil is a promising candidate as growth promoter and health modulator and the results concerning stress response were encouraging. Essential oils of oregano and cinnamon, due to the unstable volatile molecules and the large quantity tested, did not show positive results on growth and stress response. Further investigation of the effect of these essential oils on sea bream in smaller quantities is recommended.Η ευζωία των ψαριών αποτελεί πλέον σημαντική προτεραιότητα τόσο για τους παραγωγούς όσο και για τους καταναλωτές, καθώς υπάρχει ολοένα και μεγαλύτερη ζήτηση για ασφαλή και ποιοτικά προϊόντα προερχόμενα από εκτροφές φιλικές προς τα ζώα. Στην υποβάθμιση της ευζωίας συμβάλλει σε ένα πολύ μεγάλο ποσοστό η καταπόνηση (stress), η οποία προκαλείται σε μεγάλο βαθμό από τις διαχειριστικές πρακτικές που εφαρμόζονται στις ιχθυοκαλλιέργειες. Στη διεθνή βιβλιογραφία, τις τελευταίες δύο δεκαετίες, έχουν πραγματοποιηθεί πολλές μελέτες σχετικά με την ευεργετική χρήση των φαρμακευτικών φυτών στη διατροφή των παραγωγικών ζώων και πιο πρόσφατα αυξήθηκε ο αριθμός των επιστημονικών μελετών σχετικά με την εφαρμογή αυτών των εναλλακτικών πρόσθετων στην παραγωγή των ψαριών με σκοπό την υγεία και κατ’ επέκταση την ευζωία. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της επίδρασης τριών φαρμακευτικών φυτών (αιθέριου ελαίου ρίγανης Origanum vulgare, αιθέριου ελαίου κανέλας Cinnamomun zeylanicum και ελαίου σπόρων βιομηχανικής κάνναβης Cannabis sativa) στην ανάπτυξη και θρεπτική αξία της τσιπούρας και στην απόκριση στο stress προκαλούμενο από έντονους χειρισμούς, ασιτία και υψηλή ιχθυοπυκνότητα. Στην κατάρτιση των σιτηρεσίων έγινε προσθήκη των φαρμακευτικών φυτών σε ποσοστό 1% και 2% της τροφής. Διεξήχθησαν συνολικά τέσσερα πειράματα. Στο 1ο πείραμα, διάρκειας 74 ημερών, τα ψάρια διατράφηκαν με τα πειραματικά σιτηρέσια και αξιολογήθηκε η ανάπτυξη και θρεπτική σύσταση του σώματος. Επίσης, διερευνήθηκε η κατάσταση της υγείας των ψαριών μέσω αιματολογικών παραμέτρων και το επίπεδο της καταπόνησης μέσω των επιπέδων της κορτιζόλης στο αίμα και της βλάβης του DNA στους ιστούς. Πραγματοποιήθηκαν ιστολογικές αναλύσεις, διερεύνηση του προφίλ λιπαρών οξέων και προσδιορισμός των νευροδιαβιβαστών του εγκεφάλου μέσω μοντέλων πρόβλεψης και τέλος, αξιολογήθηκε η συμπεριφορά των ψαριών κατά την τροφοληψία. Η προσθήκη ελαίου σπόρων κάνναβης δεν επέφερε θνησιμότητες και έδειξε ανάπτυξη (χωρίς σημαντικές διαφορές) ενώ δεν επέφερε σημαντικές διαφοροποιήσεις στη θρεπτική σύσταση. Στις ομάδες με προσθήκη αιθέριων ελαίων ρίγανης και κανέλας παρατηρήθηκε μειωμένη επιβίωση, με τις ομάδες που διατρέφονταν σε ποσοστό 2% να έχουν το υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας. Στις ομάδες με προσθήκη 1% ρίγανης και κανέλας δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις στην ανάπτυξη ενώ οι ομάδες με ποσοστό προσθήκης 2% έδειξαν σημαντικά χαμηλότερη κατανάλωση τροφής, αύξηση βάρους, ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (SGR) και χαμηλότερο συντελεστή μετατρεψιμότητας της τροφής (FCR) και συντελεστή διατήρησης λίπους (LR). O ηπατοσωματικός δείκτης (HSI) και ο δείκτης ευρωστίας (K) δεν έδειξαν σημαντικές διαφοροποιήσεις σε καμία διατροφική ομάδα. Ο προσδιορισμός της θρεπτικής σύστασης των ομάδων ρίγανης και κανέλας σε ποσοστό 2% έδειξε σημαντική αύξηση των πρωτεϊνών, της τέφρας και της ενέργειας στο ολικό σώμα των ψαριών, ενώ το λίπος ήταν σημαντικά χαμηλότερο. Οι αιματολογικές παράμετροι που προσδιορίστηκαν (Ht, RBC, WBC και DLC) και τα επίπεδα κορτιζόλης στο πλάσμα δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές σε καμία διατροφική ομάδα, ενώ η βλάβη του DNA ήταν υψηλότερη για την ομάδα OR1% στα ηπατοκύτταρα και στα κύτταρα του εντέρου. Περαιτέρω, η προσθήκη ελαίου σπόρων κάνναβης και αιθέριου ελαίου κανέλας σε ποσοστό 2% προκάλεσε ηπατική στεάτωση και κενοτοπίωση του κυτταροπλάσματος, ενώ στα δείγματα του πρόσθιου εντέρου όλων των διατροφικών μεταχειρίσεων δεν βρέθηκαν ιστομορφολογικές αλλοιώσεις και παθολογικά ευρήματα. Ο προσδιορισμός του προφίλ λιπαρών οξέων στο ολικό σώμα των ψαριών έδειξε ότι τα πειραματικά έλαια διατήρησαν τη λιπιδική σύσταση και ποιότητα χωρίς ιδιαίτερες μεταβολές. Ο προσδιορισμός των νευροδιαβιβαστών του εγκεφάλου με βάση τα μοντέλα πρόβλεψης δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στην περίπτωση της προσθήκης των αιθέριων ελαίων ρίγανης και κανέλας στην τροφή των ψαριών, ενώ η προσθήκη του ελαίου σπόρων βιομηχανικής κάνναβης προκάλεσε σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης 5-ΗΤ και σημαντική μείωση του μεταβολίτη της 5-HIAA στην ομάδα CAN2% σε σχέση με την ομάδα CAN1%. Επίσης, ο λόγος DOPAC/DA στο ρομβοειδή εγκέφαλο βρέθηκε σημαντικά μεγαλύτερος στις ομάδες CAN1% και CIN2% από τις αντίστοιχες ομάδες CAN2% και CIN1%, χωρίς σημαντικές διαφορές από την ομάδα ελέγχου. Η μελέτη της διατροφικής συμπεριφοράς των ψαριών έδειξε ότι το αιθέριο έλαιο ρίγανης και κανέλας προκάλεσε δυσαρέσκεια στα ψάρια, πιθανότατα λόγω της έντονης μυρωδιάς, με αποτέλεσμα τη λήψη της τροφής κυρίως από τον πυθμένα της δεξαμενής, ενώ το έλαιο από σπόρους κάνναβης καταναλώθηκε από τα ψάρια ταχύτερα. Συμπερασματικά, η προσθήκη αιθέριου ελαίου ρίγανης (O.vulgare) και κανέλας (C.zeylanicum) δεν είναι κατάλληλη για τη διατροφή σε νεαρά άτομα τσιπούρας σε αυτή την ποσότητα (20gr/Kg) καθώς αναστέλλει την ανάπτυξη και προκαλεί σημαντική αύξηση της θνησιμότητας. Η προσθήκη των εξεταζόμενων αιθέριων ελαίων σε ποσοστό 1% χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Το έλαιο σπόρων κάνναβης του είδους C.sativa σε ποσοστό 1% προτείνεται για χρήση στη διατροφή της τσιπούρας ως προαγωγός ανάπτυξης. Το 2ο πείραμα είχε ως σκοπό τη διερεύνηση της επίδρασης της οξείας καταπόνησης, προκληθείσας μέσω έντονων χειρισμών της απόχης για 5min μετά από τροφοληψία των ψαριών με τα πειραματικά σιτηρέσια για 84 ημέρες. Στο τέλος, διερευνήθηκε η κατάσταση της υγείας των ψαριών μέσω αιματολογικών παραμέτρων και το επίπεδο της καταπόνησης μέσω των επιπέδων της κορτιζόλης στο πλάσμα και της βλάβης του DNA στο ήπαρ και στο αίμα. Ο προσδιορισμός των αιματολογικών παραμέτρων δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στον Ht, RBC και WBC σε καμία διατροφική ομάδα, ενώ παρατηρήθηκε σημαντικά αυξημένος αριθμός λεμφοκυττάρων και σημαντικά μικρότερος αριθμός κοκκιοκυττάρων στις ομάδες που διατρέφονταν με αιθέριο έλαιο ρίγανης. Η κορτιζόλη στο πλάσμα του αίματος βρέθηκε μειωμένη μετά από την τροφοληψία με το έλαιο σπόρων κάνναβης και αιθέριο έλαιο κανέλας. Η βλάβη στο DNA στα ηπατοκύτταρα βρέθηκε εκτεταμένη σε όλες τις διατροφικές ομάδες εκτός από την ομάδα που διατρέφονταν με έλαιο σπόρων κάνναβης σε ποσοστό 1%, ενώ η βλάβη του DNA στα ερυθροκύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερη μόνο στην ομάδα που διατρέφονταν με αιθέριο έλαιο κανέλας σε ποσοστό 2%. Συμπερασματικά, το έλαιο σπόρων κάνναβης σε ποσοστό 1% φάνηκε να είναι το πιο αποτελεσματικό ως παράγοντας anti-stress μετά από την υποβολή των ψαριών σε έντονους χειρισμούς, ωστόσο είναι σημαντικό να γίνουν περαιτέρω μελέτες σχετικά με την επίδραση αυτών των φαρμακευτικών φυτών στο οξύ stress. To 3o πείραμα είχε σκοπό τη διερεύνηση της επίδρασης της ασιτίας 14 ημερών μετά από τροφοληψία των ψαριών με τα πειραματικά σιτηρέσια για 84 ημέρες. Στο τέλος της πειραματικής διαδικασίας, διερευνήθηκε η κατάσταση της υγείας των ψαριών μέσω του αιματολογικού προφίλ και το επίπεδο της καταπόνησης μέσω των επιπέδων της κορτιζόλης στο πλάσμα και της βλάβης του DNA στο ήπαρ και στο αίμα. Από τα αποτελέσματα των αιματολογικών παραμέτρων παρατηρήθηκε ότι στις ομάδες που διατρέφονταν καθ΄ όλη τη διάρκεια και τις ομάδες που υποβλήθηκαν σε ασιτία παρατηρήθηκε μία τάση μείωσης του αριθμού RBC και WBC, με σημαντικές διαφορές στις ομάδες της κάνναβης και της κανέλας, αλλά χωρίς σημαντικές διαφορές από την ομάδα ελέγχου που σιτίζονταν κανονικά. Οι ομάδες που σιτίζονταν με αιθέριο έλαιο ρίγανης σε ποσοστό προσθήκης 1% (OR1%) καθ’ όλη τη διάρκεια του πειράματος άλλα και αυτές που υποβλήθηκαν σε ασιτία είχαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό WBC από τις αντίστοιχες ομάδες ελέγχου. Τα επίπεδα της κορτιζόλης έδειξαν σημαντική μείωση της κορτιζόλης στο πλάσμα του αίματος μετά την υποβολή των ψαριών σε ασιτία σε όλες τις διατροφικές ομάδες εκτός της ομάδας που διατρέφονταν με αιθέριο έλαιο ρίγανης σε ποσοστό 2%. Χαμηλότερη βλάβη του DNA βρέθηκε, επίσης, σε όλες τις ομάδες που διατρέφονταν με τα φυτοφαρμακευτικά πρόσθετα, ενώ στο αίμα δεν φάνηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις, εκτός από την ομάδα που διατρέφονταν με αιθέριο έλαιο κανέλας σε ποσοστό 1% (CIN1%), η οποία μείωσε τη γενοτοξικότητα σημαντικά. Συμπερασματικά, η προσθήκη αιθέριου κανέλας σε ποσοστό 1% φάνηκε να είναι η πιο αποτελεσματική στην απόκριση του stress μετά την υποβολή των ψαριών σε stress λόγω παρατεταμένης ασιτίας διάρκειας 14 ημερών. Το 4ο πείραμα είχε ως σκοπό τη διερεύνηση της επίδρασης των φυτοφαρμακευτικών πρόσθετων στην απόκριση του stress λόγω χρόνιας καταπόνησης προκαλούμενης από αύξηση της πυκνότητας εκτροφής για δύο μήνες. Οι δύο ιχθυοπυκνότητες που εφαρμόστηκαν ήταν 1,2m3/Kg (χαμηλή ιχθυοπυκνότητα) και 2m3/Kg (υψηλή ιχθυοπυκνότητα). Στο τέλος της πειραματικής διαδικασίας, διερευνήθηκε η κατάσταση της υγείας των ψαριών μέσω του αιματολογικού προφίλ και το επίπεδο της καταπόνησης μέσω των επιπέδων της κορτιζόλης στο πλάσμα και της βλάβης του DNA στα ηπατοκύτταρα και ερυθροκύτταρα. Στην παρούσα μελέτη ενώ παρατηρήθηκε μία τάση μείωσης των WBC στις ομάδες σε υψηλή ιχθυοπυκνότητα δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές με την ομάδα ελέγχου που διατρέφονταν κανονικά. Η απόκριση της κορτιζόλης ήταν χαμηλότερη σε όλες τις ομάδες που διατρέφονταν με τα φυτοφαρμακευτικά πρόσθετα σε ποσοστό 2% στην υψηλή ιχθυοπυκνότητα, ενώ παρατηρήθηκαν υψηλά επίπεδα σε όλες τις διατροφικές ομάδες με ποσοστό προσθήκης 1% στη χαμηλή και στην υψηλή ιχθυοπυκνότητα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η προσθήκη των φυτοφαρμακευτικών πρόσθετων σε ποσοστό 1% ήταν πιο αποτελεσματική σε σύγκριση με την προσθήκη σε ποσοστό 2% στη μείωση της βλάβης του DNA στα ηπατοκύτταρα στην υψηλή ιχθυοπυκνότητα, ωστόσο μόνο οι ομάδες που διατρέφονταν με έλαιο σπόρων κάνναβης και αιθέριο έλαιο ρίγανης σε ποσοστό 1% είχαν σημαντικά χαμηλότερες τιμές. Στη βλάβη του DNA δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις ανάμεσα στις διατροφικές ομάδες και τις ομάδες ελέγχου στην υψηλή και χαμηλή ιχθυοπυκνότητα. Συμπερασματικά, δεν μπορούμε να πούμε ότι κάποιο από τα εξεταζόμενα φυτοφαρμακευτικά πρόσθετα ήταν απόλυτα αποτελεσματικό στη μείωση της απόκρισης καταπόνησης προκαλούμενη από χρόνιο stress λόγω υψηλής ιχθυοπυκνότητας για 2 μήνες, ωστόσο θέτει βάσεις για περαιτέρω διερεύνηση. Τέλος, δημιουργήθηκε πρότυπο αξιολόγησης της ευζωίας των ιχθύων κατά την εντατική εκτροφή. Ως γενικό συμπέρασμα της διδακτορικής διατριβής θα μπορούσαμε να πούμε ότι το έλαιο από σπόρους κάνναβης είναι ένας πολύ καλός υποψήφιος ως προαγωγός ανάπτυξης της τσιπούρας και τα αποτελέσματα που αφορούν την απόκριση της καταπόνησης ήταν ενθαρρυντικά. Τα αιθέρια έλαια ρίγανης και κανέλας, λόγω των ασταθών πτητικών ενώσεων που περιέχουν και της μεγάλης ποσότητας που δοκιμάστηκε, δεν έδειξαν ικανοποιητικά αποτελέσματα τόσο στην ανάπτυξη της τσιπούρας όσο και στην απόκριση της καταπόνησης. Συστήνεται η περαιτέρω διερεύνηση της επίδρασης αυτών των αιθέριων ελαίων στην τσιπούρα σε μικρότερες ποσότητες