Characterising structural heterogeneity of prions: Using synthetic protein libraris (Alphareps) for the study of cellular and Scrapie prion conformers

Les prions causent des maladies neurodégénératives fatales comme le « variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob » qui a franchi la barrière des espèces et s’est adapté à l’Homme à partir de la maladie «de la vache folle» des bovins. Les mécanismes moléculaires impliqués dans le franchissement de la barrière d’espèce et l’adaptation du prion à son nouvel hôte ne sont encore que partiellement élucidés, on suppose qu’ils font appel à la sélection du «meilleur réplicateur» parmi une multitude de conformations de PrPSc (le conformère pathologique et autoréplicatif de la protéine prion cellulaire PrPC). En tout état de cause, les différentes conformations de PrPSc mises en évidence par un grand nombre d’approches biochimique, biophysique ou même en bioessai reposent quasi-exclusivement sur des modifications structurales, et non sur des modifications de séquence primaire. Dans le but de disposer d’outils permettant de mieux isoler et caractériser ces variants structuraux de la PrP, notre projet a consisté à isoler et purifier ces conformères de PrPSc et à les utiliser pour cribler des banques de bactériophages exprimant des peptides aléatoires structurés au sein de motifs protéiques appelés alphaRep. Dans une première approche, des monomères de PrP recombinante, dépourvus de leur extrémité N-terminale (non structurée) ont été immobilisés sur une surface de polystyrène : le monomère sauvage (WT) ainsi que deux mutants de délétion, incapables de se polymériser, ont servi à cribler la banque d’AlphaReps. Un total de16 alphaReps différentes ont ainsi pu être sélectionnées et leurs interactions avec différents mutants de PrP monomérique caractérisées par ELISA ou par calorimétrie. Des affinités variant du nanomolaire pour le meilleur interactant (W-E5) au micromolaire ont ainsi pu être mesurées. Les affinités mesurées par calorimétrie (ITC) sont généralement plus faibles (aux alentours de 50nM pour WE5 par exemple), ce qui suggère des phénomènes d‘avidité pour les mesures par ELISA. Certaines alphaRep en revanche présentent des affinités comparables en ELISA et en ITC (55nM en ELISA et 24nM en ITC pour H2Y2-F4). Les mesures d’affinités par calorimétrie sur les mutants de PrP sont plus difficiles à interpréter et suggèrent l’existence de réarrangements structuraux, associés ou non à des phénomènes de condensation / polymérisation qui restent encore à caractériser.Comme la PrP est naturellement glycosylée, les AlphaReps précédemment sélectionnées ont été évaluées pour leur capacité de fixer la protéine native, soit purifiée et enrichie au moyen de colonnes de nickel puis d’anticorps spécifiques ; des essais de marquages directs de la membrane des cellules, mais ces alphaReps semblent être incapables de se fixer sur de la PrP native. Une nouvelle série de criblages de la banque d’AlphaRep a donc été entreprise en utilisant la protéine native purifiée ou directement des cellules surexprimant la PrP comme crible. Cette approche s’est révélée assez frustrante dans la mesure où les AlphaReps sélectionnées ne présentent pas de meilleure affinité pour la protéine native, en comparaison avec la protéine recombinante - dépourvue de glycosylations.Enfin, la banque d’AlphaReps a été criblée sur deux préparations de fibres de PrP – humaine et murine – immobilisées sur polystyrène. Les études sont encore en cours, mais suggèrent dès à présent que de nombreuses AlphaReps sélectionnées reconnaissent de manière analogue les fibres d’origine humaine et murine, ce qui est à mettre en rapport avec les similitudes structurales et biologiques entre les deux prions. Cela corrobore d’ailleurs les observations faites avec la PrP monomérique puisque les premiers criblages avaient sélectionné quelques AlphaReps identiques à partir de cibles différentes (notamment entre les deux PrP mutantes utilisées). Cependant, il semble que nous avons été capables d’isoler aussi des AlphaRep spécifiques des formes murine ou humaine des fibres de PrP. Les protéines recombinantes sont en cours de production pour permettre de caractériser plus en détail ces interactants structuraux des prions. Ces ligands conformation-spécifiques pourront servir dans des approches diagnostique, applicables à d’autres pathologies neurodégénératives d’intérêt médical ou vétérinaire