Role of the Cdkn2a Cell Cycle Regulator in Adipose Tissue Plasticity and Function and Type 2 Diabetes

La dérégulation de la balance énergétique et l'obésité sont des problèmes de santé publique conduisant au développement de pathologies métaboliques comme le diabète de type 2 (DT2) ou les maladies cardiovasculaires. Les études pangénomiques ont établi que la région du gène suppresseur de tumeur CDKN2A (inhibiteur 2a de kinase dépendante des cyclines) était associée à une augmentation du risque de DT2. Ce locus présente une double fonction dans la régulation du cycle cellulaire et du métabolisme énergétique. L'expression de CDKN2A est notamment augmentée dans le tissu adipeux (TA) des personnes obèses.Nous avons montré précédemment que les souris globalement déficientes en Cdkn2a nourries avec un régime hyperlipidique hypercalorique (DIO) sont résistantes à l'obésité et présentent une augmentation de la thermogenèse via le brunissement du TA sous-cutané et une amélioration de la sensibilité à l'insuline. Afin d'établir si le brunissement est dû à un phénomène de transdifférenciation adipocytaire, nous avons étudié l'effet de l'invalidation de Cdkn2a spécifiquement dans l'adipocyte différencié (Cdkn2aad-/-) chez la souris DIO en établissant leur profil métabolique, hormonal et histologique. Les souris Cdkn2aad-/- présentent un meilleur profil métabolique que les souris sauvages avec une tolérance au glucose améliorée sans modification de la sensibilité à l'insuline, une hypoleptinémie et une hyporésistinémie, associées à un remodelage cellulaire des dépôts de TA et à une augmentation de la dépense énergétique, sans brunissement visible. L'analyse transcriptomique par séquençage de l'ARN des différents dépôts de TA a montré que seul le TA épididymal présente une augmentation globale des voies métaboliques impliquées dans l'utilisation des substrats énergétiques et l'activité oxydative, en particulier le métabolisme du glucose. Ces résultats ont été validés par la méthode Seahorse et par mesure de la capture du glucose après invalidation de l'expression de Cdkn2a par siRNA dans la lignée adipocytaire 3T3-L1. L'analyse de l'activité kinase a été également effectuée afin d'étudier les voies impliquées.Des données préliminaires ont montré que l'extinction de CDKN2A à l'aide de siARN lors de la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines engagées dans la lignée adipocytaire brune (hiPSC-BAPs) entraîne une augmentation des marqueurs de la thermogenèse. En parallèle du modèle souris, des hiPSC-BAPs différenciés en sphéroïdes 3D transfectés à l'aide de siARN ont été développés afin d'étudier l'implication de CDKN2A dans l'initiation d'un programme thermogénique au stade progéniteur. Des analyses du transcriptome et de l'activité kinase ont montré que l'extinction de CDKN2A active les voies impliquées dans l'adipogenèse, le métabolisme oxydatif et potentialise le processus de brunissement, entraînant une reprogrammation des hiPSC-BAPs différenciés en adipocytes de type brun.L'ensemble de ces données suggère que le brunissement observé lors de l'invalidation globale de Cdkn2a chez la souris n'est pas dû à une transdifférenciation des adipocytes. Cependant, Cdkn2a activerait les voies du métabolisme énergétique et potentialiserait le brunissement de l'adipocyte par des voies indépendantes de celles utilisées pour moduler le cycle cellulaire. De plus, l'extinction de CDKN2A dans les hiPSC-BAPs montre que cet effet cellulaire est autonome. Ces deux approches combinées ont permis de mettre en évidence des voies adipocytaires communes sous le contrôle de CDKN2A (telles que l'AMPK et la p70S6K) associées au brunissement adipocytaire. La mise en évidence des voies moléculaires contrôlées par CDKN2A dans l'adipocyte impliquées dans le brunissement est une première étape pour la mise en place d'approches thérapeutiques visant à activer le brunissement afin d'atténuer les effets délétères de l'obésité sur la résistance à l'insuline et de DT2.Disorders of energy balance during obesity are a major health problem with consequences on the development of metabolic pathologies such as type 2 diabetes (T2D) or cardiovascular diseases. Genome-wide studies have established that the tumor suppressor gene region CDKN2A (cyclin-dependent kinase 2a inhibitor) is associated with T2D risk. This locus has a dual function in regulating the cell cycle and energy metabolism. In particular, the expression of CDKN2A is increased in the adipose tissue (AT) of obese subjects.We have previously shown that globally Cdkn2a-deficient mice fed a high-fat diet (DIO) are resistant to obesity with increased thermogenesis via browning of subcutaneous TA and improvement of insulin sensitivity. In order to assess whether browning is due to adipocyte transdifferentiation, we studied the effects of the invalidation of Cdkn2a restricted to adipocyte (Cdkn2aad-/-) in DIO mice by determining their metabolic, hormonal and histological profile. Cdkn2aad-/- mice exhibit a better metabolic profile than wild-type mice with improved glucose tolerance without modification of insulin sensitivity, hypoleptinemia and hyporesistinemia. They also display cellular remodeling of TA deposits associated with an increase in energy expenditure without visible browning. Transcriptomic analysis by RNA sequencing of different fat pads shows that only epididymal AT exhibits an overall increase in the metabolic pathways involved in the utilization of energy substrates and oxidative activity, in particular glucose metabolism. These findings have been validated by Seahorse and measurement of glucose uptake in CDKN2A-deficient 3T3-L1 cells differentiated into adipocyte using siRNA methodology. A global kinome analysis has also been carried out to investigate the pathways involved.Previous data have shown that the suppression of CDKN2A expression using siRNA during differentiation of human induced pluripotent stem cells committed to the brown adipogenic lineage (hiPSC-BAPs) results in an increase in the thermogenic marker UCP1. In parallel, hiPSC-BAPs cultured in 3D spheroids transfected with siRNAs were developed in order to understand how CDKN2A mediates the initiation of a thermogenic program at the progenitor stage. RNA sequencing and kinase activity profiling analyses have shown that CDKN2A silencing enhances pathways involved in adipogenesis, oxidative metabolism, and browning process, resulting in reprogramming of brown-like adipocytes by promoting the expression of browning markers.Overall, these data suggest that browning observed during global Cdkn2a knockdown in mice is not due to adipocyte transdifferentiation. However, CDKN2A might control global cellular oxydative metabolism in adipocyte via alternative pathways from those used for regulating the cell to potentiate browning process. CDKN2A knockdown in hiPSC-BAPs demonstrated that this locus plays an important role in brown-like adipogenic maturation in a cell-autonomous manner. Both models have highlighted common pathways (i.e., l'AMPK and p70S6K) regulated by CDKN2A that are involved in adipocyte browning. Finding and targeting new signaling pathways driving browning may constitute a great scientific breakthrough and may help to develop therapeutic approach against obesity and T2D