Compréhension des premières étapes de nucléation de l’apatite biomimétique

This work is dedicated to the study of the early stages of hydroxyapatite formation, a calcium phosphate phase whose composition is Ca10(PO4)6(OH)2. The crystallization mechanism of this material of biological interest (main component of bones and teeth) has recently been described as non-classical. In the latter, solute ionic clusters dubbed « prenucleation clusters » (PNC) form and aggregates before nucleating in an amorphous phase that later evolve towards hydroxyapatite. Prenucleation clusters are difficult to characterize because of their soluble nature, their nanometric size and their dynamic behavior (ionic exchanges, fast kinetics of formation and aggregation). Hence, few studies struggle to access their structure and composition due to a lack of appropriate characterization methods. In this thesis, we aim to characterize the structure and dynamics of such prenucleation clusters at the atomic scale developing suitable methodologies. To do so, we used time-resolved techniques combining in situ measurements such as calcium potentiometry, solution NMR and pH measurements with cryogenic approaches such as cryo-TEM and solid-state NMR onto vitrified solution. The latter consists of vitrifying metastable solutions to strongly reduce the dynamics and characterize the structure of transient species at specific time points. We studied the influence of precipitation parameters under physiological-like conditions (phosphate and calcium concentrations, pH, ionic strength and temperature) onto the formation of biomimetic hydroxyapatite. In such conditions, biomimetic hydroxyapatite follows a non-classical mechanism involving several transient species, such as PNC, amorphous calcium phosphate and octacalcium phosphate-like phase. We found that PNC composition remained unchanged no matter the initial parameters of precipitation and can be described as calcium triphosphate entities Ca(HPO4)2(H2PO4)3-. Nonetheless, initial parameters define the amount of PNC which directly governs the kinetics of nucleation. This allowed us to describe prenucleation clusters as calcium triphosphate ions Ca(HPO4)2(H2PO4)3-. Similar approaches were performed to study all transient species preceding biomimetic HAP crystallization in purely inorganic conditions and in presence of polyaspartic acid. The latter mimics acidic proteins that are believed to drive nucleation and crystallization in vivo.Cette thèse s’intéresse aux premières étapes de formation de l’hydroxyapatite, une phase de phosphate de calcium de composition, Ca10(PO4)6(OH)2, qui est la composante majoritaire des os et dents. Il a récemment été proposé que cette phase se forme suivait un mécanisme de nucléation non-classique impliquant la formation de clusters solubles de taille nanométrique appelés « clusters de prénucléation » (PNC) s’agrégeant au cours du temps avant de nucléer en une phase solide amorphe évoluant par la suite en hydroxyapatite. Les PNC sont des entités particulièrement mal comprises. L’état soluble, la taille nanométrique, la dynamique d’échange entre les ions mais aussi les cinétiques de formation et d’agrégation des PNC qui peuvent être très rapides compliquent leur étude. Faute de méthodes de caractérisation adaptées, il n’y a pas encore de consensus sur la composition, la structure ou la caractérisation de la dynamique de ces clusters. Cette thèse vise à caractériser ces paramètres en développant des méthodologies d’analyse à l’échelle atomique adaptées à ces espèces. Pour cela, nous avons utilisé des méthodes résolues dans le temps en combinant des mesures in situ par potentiométrie du calcium, pH-métrie et RMN en solution. Nous nous sommes aussi attachés à des méthodes de caractérisation de solutions cryo-fixées telles que le cryo-TEM et la RMN à l’état solide hyperpolarisée. Cette dernière approche a été particulièrement développée de manière à stopper la réactivité à des instants bien définis pour caractériser les espèces transitoires. Appliquant ces méthodes, nous avons étudié l’influence de divers paramètres initiaux sur la précipitation d’hydroxyapatite biomimétique. Pour cela, nous nous sommes placés dans des conditions proches de la physiologie en termes de i) concentrations ioniques, ii) de pH, iii) de force ionique et iv) de température. Dans ces conditions, la formation d’hydroxyapatite biomimétique suit un mécanisme non-classique impliquant différentes espèces transitoires : les PNC, une phase amorphe, ainsi qu’une phase proche structurellement de l’octacalcium phosphate. Qu’elles que soient les conditions de précipitation, nous avons notifié que la composition des PNC était préservée et que ces derniers pouvaient être décrits comme des entités de calcium triphosphate Ca(HPO4)2(H2PO4)3-. Par ailleurs, les conditions de précipitation définissent la quantité de PNC formée et la cinétique de nucléation est d’autant plus rapide que les concentrations en PNC sont élevées. Des méthodologies similaires nous ont permis de décrire les phases solides transitoires précédant la formation d’hydroxyapatite biomimétique en l’absence et en présence d’acide polyaspartique, un additif mimant les actions des protéines acides in vivo suspectées de contrôler la minéralisation osseuse