Caracterização química e avaliação de extratos de sementes de abóbora (Cucurbita maxima Duchesne) e abacate (Persea americana Mill) contra helmintos de pequenos ruminantes

Orientador: Profa. Dra. Juliana Bello Baron MaurerCoorientador: Prof. Dr. Marcelo Beltrão MolentoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 29/08/2018Inclui referênciasResumo: Hoje em dia a contaminação das ovelhas por parasitas é global e o tratamento e metodologias de controle não são eficientes. O frequente tratamento destes animais com medicamentos alopáticos selecionou parasitas resistentes por isso, é necessário que outras formas de tratamentos sejam pesquisadas, uma delas é a fitoterapia. O objetivo deste estudo foi caracterizar os extratos e frações de sementes de Persea americana Mill. (Abacate) e Cucurbita maxima (abóbora), determinando a composição e a atividade anti-helmíntica in vitro contra larvas de terceiro estágio (L3) de Haemonchus contortus, parasito de ruminantes. As sementes de abacate e abóbora frescas (F) e secas (H) foram submetidas à extração com água quente (W-PAF, W-PAH - abacate e W-CMF, W-CMH - abóbora), etanol (E-PAF, EPAH, E-CMF, E-CMH - abóbora) ou metanol a 70% (v/v) e partição com solventes de polaridade crescente [n-hexano (H-PAF, H-PAH - abacate, H-CMF, H-CMH - abóbora), clorofórmio (C-PAF, C-PAH - abacate, C-CMF, C-CMH - abóbora), acetato de etila (Ea- PAF, Ea-PAH - abacate, Ea-CMF, Ea-CMH - abóbora) e n-butanol (B-PAF, BPAH - abacate, B-CMF, B-CMH - abóbora)], produzindo um total de 14 extratos, também denominado de frações, para cada espécie. Depois de considerar o rendimento, a solubilidade em água e os resultados do teste de migração larval (TML), os extratos/frações E-PAF, EPAH, H-PAF, H-PAH, H-CMF e H-CMH foram selecionadas para experimentos posteriores. E-PAH apresentou concentração de eficiência de 50% (EC50) de 36 µg/mL e H-CMH de 63 µg/mL no TML. E-PAH mostrou a maior eficiência, quando sua EC50 foi comparada às demais frações extraídas das sementes de abacate (E-PAF = 147 µg/mL, H-PAF = 800 µg/mL, H-PAH = 77 ?g/mL). Em seguida, o extrato E-PAH foi caracterizado quimicamente, considerando seus teores de polifenólicos e flavonoides quantitativos por técnicas colorimétricas e cromatográficas. E-PAH apresentou 50, 38 e 24 mg/g de matéria seca de fenol total, taninos condensados (TC) e de flavonoides, respectivamente. Utilizando análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), o extrato E-PAH mostrou ter epicatequina (4,7 µg/mL), rutina (2,8 µg/mL), ácido clorogênico (1,4 µg/mL) e quercetina (não quantificado), como seus principais constituintes. Estes compostos foram avaliados utilizando o TML para relacionar a composição com a atividade anti-helmíntica observada para a E-PAH. Quercetina (EC50 = 7,8 µg/mL) e epicatequina (EC50 = 10 µg/mL) apresentaram maior eficiência que a rutina (EC50 = 30 µg/mL). O ácido clorogênico também foi testado com o TML, mas não apresentou eficiência significativa. De acordo com os resultados, a composição fenólica do extrato E-PAH e de valores de EC50 obtidos para os fenóis isolados, pode-se sugerir que, além do teor de TC, a presença de epicatequina e rutina contribuiram para a atividade antiparasitária/larvicida da E-PAH. Na eclodibilidade de ovos, E-PAH atingiu 0% de eclosão e esta atividade pode estar associada à presença de ácido clorogênico no extrato. H-CMH apresentou concentração de eficiência de 50% (EC50 =) menor quando comparada às demais frações extraídas das sementes de abóbora (H-CMF = 700 µg/mL). Em seguida, a fração H-CMH foi caracterizada química e fitoquimicamente, considerando seus teores de polifenólicos e flavonoides quantitativos por técnicas colorimétricas. H-CMH apresentou 64 e 5 mg/g de matéria seca de carboidrato total e TC, respectivamente. Na eclodibilidade de ovos, o extrato E-CMF atingiu 8% de eclosão e esta atividade pode estar relacionada com a presença de cucurbitacina B, uma vez que este composto foi identificado no extrato metanólico de C. moschata, uma abóbora do mesmo gênero. Em conclusão, as sementes de abacate e abóbora podem ser usadas como fonte de polifenóis com aplicações anti-helmínticas promissoras.Abstract: Today, the contamination of sheep by parasites is a global problem and the treatment and control methodologies are not efficient. The frequent treatment of these animals with synthetic drugs has triggered resistance in the parasites so it is necessary that other forms of treatments be researched, one of them is phytotherapy. The aim of this study was to characterize the extracts and fractions of Persea americana Mill. (avocado) and Cucurbita maxima (pumpkin) seeds and to determine the composition and the in vitro anthelmintic activity against third stage larvae (L3) of Haemonchus contortus. The fresh (F) and dried (H) seeds of avocado (PA) and pumpkin (CM) were subjected to extraction with hot water (WPAF, W-PAH - avocado / W-CMF, W- E-PAH / E-CMF, E-CMH - pumpkin) or methanol 70% (v/v), and partition with solvents of increasing polarity [n-hexane (H-PAF, H-PAH - avocado / H-CMF , H-CMH (pumpkin), chloroform (C-PAF, C-PAH-avocado / C-CMF, CCMH- pumpkin), ethyl acetate (Ea-PAF, Ea-PAH- avocado / Ea - CMF, Ea - CMH - pumpkin) and n-butanol (B-PAF, B-PAH-avocado / B-CMF, B-CMH-pumpkin)] yielding a total of 14 extracts/ fractions for each species. After considering the yield, water solubility, and the preliminary results of the larval migration test (LMT), the E-PAF, E-PAH, H-PAF, and H-PAH were selected for further experiments. E-PAH presented an efficiency concentration of 50% (EC50) of 36 µg/mL on the LMT. E-PAH showed the greatest efficiency when its EC50 was compared to the other fractions (E-PAF=147 µg/mL; HPAF = 801 µg/mL; H-PAH = 77 µg/mL). After that, the E-PAH was chemically characterized, considering its quantitative polyphenolic and flavonoid contents by colorimetric and chromatographic techniques. E-PAH presented 50, 38, and 24 mg/g of dry matter of total phenol, condensed tannins (CT), and flavonoid contents, respectively. Using high performance liquid chromatography (HPLC) analysis, E-PAH had shown to have epicatechin (4.7 µg/mL), rutin (2.8 µg/mL), and chlorogenic acid (1.4 µg/mL) as its main constituents besides quercetin. These isolated compounds were evaluated using the LMT in order to relate the composition to the anthelmintic activity observed for E-PAH. Quercetin (EC50=7.8 µg/mL) and epicatechin (EC50=10 µg/mL) presented a higher efficiency than rutin (EC50=30 µg/mL). Chlorogenic acid was also tested with the LMT but did not present a significant efficiency. According to the results, the phenolic composition of E-PAH and the EC50 values obtained for the isolated phenols, it can be suggested that, besides the CT content, the presence of epicatechin and rutin contributed to the larvicidal activity of E-PAH. In egg hatchability, E-PAH reached 0% of hatching and this activity may be associated to the presence of chlorogenic acid in the extract H-CMH presented the greatest EC50 when its was compared to the other fractions extracted from pumpkin seeds (H-CMF = 700 µg/mL). After that, the H-CMH fraction was characterized chemically and phytochemically, considering its polyphenolic and quantitative flavonoid contents by colorimetric techniques. H-CMH presented 64 and 5 mg/g of total carbohydrate dry matter and condensed tannins (TC) respectively. In egg hatchability, the ECMF extract reached 8% of hatching and this activity may be related to the presence of cucurbitacin B, since this compound was identified in the methanolic extract of C. moschata, a pumpkin of the same genus. In conclusion, avocado and pumpkin seeds can be used as a source of polyphenols with promising anthelmintic applications