Développement d'une stratégie de biofonctionnalisation de nanoparticules d'or à partir de peptides superhélices et d'anticorps pour la détection du cancer du sein

RÉSUMÉ: Le cancer du sein représente aujourd’hui 25 % des cancers diagnostiqués chez les Canadiennes. Le diagnostic de la maladie et la caractérisation histologique de la tumeur sont effectués par immunohistochimie (IHC) sur des tissus mammaires prélevés chez des patientes par biopsie. L’IHC repose sur l’utilisation d’anticorps chromogènes afin de produire un signal colorimétrique si des cellules cancéreuses sont détectées dans les tissus étudiés. L’IHC est néanmoins limitée par l’existence d’une grande variabilité inter-observateur dans les diagnostics, due à la nature qualitative des analyses. Ceci peut influencer la caractérisation de la tumeur, voire provoquer des faux négatifs ou faux positifs. Afin de créer une alternative quantitative à l’IHC et en réduire la variabilité inter-observateur, des procédures immunoplasmoniques sont en développement dans le laboratoire du Pr. Meunier. Ces procédures reposent sur l’utilisation de nanoparticules métalliques pour remplacer les chromophores. En effet, les nanoparticules métalliques possèdent des propriétés uniques de résonance plasmonique stables qui permettent leur détection et leur quantification. Ainsi, biofonctionnaliser des nanoparticules métalliques avec des anticorps ciblant les cellules cancéreuses permettrait leur détection quantitative au sein de tissus mammaires, menant à un diagnostic plus fiable du cancer du sein. Ce travail traite plus particulièrement du développement d’un système modèle à base de nanoparticules d’or (AuNPs) pour la détection de HER2, un biomarqueur du cancer du sein. Une nouvelle stratégie de biofonctionnalisation est présentée pour immobiliser de manière orientée du Trastuzumab (TZM), un anticorps monoclonal contre HER2, sur des AuNPs sphériques de 100 nm de diamètre. Cette nouvelle stratégie repose sur l’utilisation des peptides « Ecoil » et « Kcoil », capables de s’organiser en superhélice par hétérodimérisation avec une forte affinité et spécificité. Pour cela, le peptide Kcoil a été greffé à la surface des AuNPs alors que son partenaire Ecoil a été ajouté aux C-terminaux des chaînes lourdes de TZM lors de sa production en bioréacteur, assurant ainsi une interaction forte et spécifique entre les anticorps et les AuNPs. Cette nouvelle approche a été comparée à deux stratégies bien connues de biofonctionnalisation non-orientée, à savoir 1) l’adsorption non-spécifique de TZM sur la surface d’or, et 2) le couplage amine entre les chaînes latérales des lysines de TZM et des acides carboxyliques présents en bout de polyéthylène glycol préalablement immobilisé sur les AuNPs. Un procédé d’analyse a été mis au point afin de systématiquement comparer la stabilité macroscopique et nanoscopique des AuNPs biofonctionnalisées, la quantité de TZM immobilisés à leur surface et leur capacité à détecter spécifiquement des cellules de cancer du sein HER2-positives. ABSTRACT: Today, 25 % of cancers diagnosed in Canadian women are breast cancers. Diagnosis of the disease and histological characterization of tumors are performed by immunohistochemistry (IHC) on breast tissues sampled from the patients during a biopsy. IHC procedures use chromogenic antibodies to produce a colorimetric signal upon detection of cancer cells in the tissue samples. Nevertheless, IHC is limited by a certain inter-observer variability in the results due to the qualitative nature of the analyses, which can influence analyses and even result in false-negative or false-positive diagnoses. In order to create a quantitative alternative to IHC with a lower inter-observer variability, immunoplasmonic procedures are currently being developed in Pr. Meunier’s lab. These procedures rely on metallic nanoparticles to replace chromophores. Metallic nanoparticles possess stable plasmonic resonance properties allowing for their detection and quantification over time. Biofunctionalization of metallic nanoparticles with antibodies specific to cancer cells will provide a tool for the quantitative detection of cancer cells in breast tissue samples, leading to a more reliable diagnosis. This work focuses on the development of a gold nanoparticles (AuNPs)-based system for the detection of the HER2 breast cancer cell biomarker. A novel biofunctionalization strategy for the oriented immobilization of Trastuzumab (TZM), a monoclonal antibody against HER2, onto 100 nm spherical AuNPs is introduced. This new strategy relies on “Ecoil” and “Kcoil” peptides, which form a coiled-coil heterodimer with high affinity and specificity. The Kcoil was grafted onto the surface of AuNPs, while its partner Ecoil was bioengineered at the C-termini of TZM’s heavy chains, allowing a strong and specific interaction between the antibodies and the nanoparticles. This novel approach was compared to two well-known non-oriented biofunctionalization strategies, namely the 1) non-specific adsorption of TZM on the gold surface and 2) amine coupling between the lysine side chains of TZM and carboxylic acid-functionalized polyethylene glycol grafted on AuNPs. An analysis workflow was developed to systematically compare the stability of all AuNPs at macroscopic and nanoscopic scale, the antibody immobilization levels on the surface of nanoparticles, and their applicability for the specific detection of HER2-positive cancer cells