Contributions to phenotypic plasticity and DNA methylation in molluscs with special emphasis on the highly invasive New Zealand mud snail Potamopyrgus antipodarum (Gray, 1843)

Increasing environmental changes primarily due to anthropogenic impacts, are affecting organisms all over the planet. In general, scientists distinguish between three different ways in which organisms can respond to environmental changes in their habitat: extinction, dispersal and adaptation. An example of organisms which are highly adaptable and can easily cope with new and changing environments are invasive species which are able to colonize new habitats with only few individuals. To successfully survive in their new environment, invasive species adapt fast to novel abiotic and biotic parameters, such as different temperature regimes. Phenotypic plasticity which enables organisms to quickly modify their phenotype to new environmental conditions, explains the success in adaptation of invasive species. While underlying mechanisms of phenotypic plasticity are not fully understood, one possible “motor” of phenotypic plasticity is epigenetics. Especially DNA methylation could explain the fast changes of the organism’s phenotype due to plasticity when experiencing changing environments, as invasive species do. DNA methylation could even contribute to the adaptation of invasive species via phenotypic plasticity, especially with clonally reproducing species. Methods such as common garden experiments with clonally reproducing species are a useful tool to differentiate between phenotypic plasticity and genetic adaptation because the confusing effects of genetic variation are lowered in clonally reproducing species. Our overall goal was to evaluate the genetic adaptive potential of New Zealand mud snail (Potamopyrgus antipodarum) populations from Europe since they went through an extreme bottleneck after colonizing Europe only 180-360 generations ago. Seemingly, two different clonal lineages colonized Europe because two 16 s rRNA and cytochrome b haplotypes were found across different European countries, haplotypes t and z. The NZMS is a highly successful invasive species that is nowadays nearly globally distributed. The shells of the NZMS show a habitat-dependent high variability and are a fitness-relevant trait. The high variability in shell morphology is due to both genetic variation and phenotypic plasticity. To disentangle genetic from environmental effects on the shell morphology NZMS, we conducted a common garden experiment. We kept asexually reproducing females from eleven European populations in climate cabinets with three different temperatures to produce offspring. We compared shell size and shape across three generations using the geometric morphometrics approach. Furthermore, we estimated reaction norms, maternal effects, broad-sense heritability, the coefficient of genetic variation (CVA) and evolvability (IA) in shell size and shape across different temperature conditions. Additionally, we investigated the reproductive rate of the parental generation. Results showed that the shell morphology of the parental generation differed across populations. In contrast, the shell morphology of offspring generations became more similar. The reaction norms of the F1 generation were rather variable across the three temperatures. However, we were able to observe a haplotype-dependent pattern across the reaction norms suggesting a restricted genetic differentiation among NZMS in Europe. We detected high heritability values in size indicating a high genetic influence. Heritability values for shape were lower than in size. Generally, heritability varied slightly depending on temperature. Size seemed to have a higher evolvability than shape. However, the values of all our calculations were very low which indicates that the European NZMS populations are genetically diminished. The reproductive rate of the parental generation was rather haplotype than temperature dependent. In summary, we were able to display that the NZMS is capable to plastically adapt its shell morphology to different temperatures showing significant differences between the two haplotypes. Nevertheless, the low evolvability values indicate that little genetic variation has formed since the arrival of the NZMS in Europe and therefore, European NZMS seem to have a reduced ability to react to selection. These results implied that phenotypic plasticity is important for the adaptation to different environmental conditions in the NZMS and maybe other molluscan species. Since classical experimental approaches can only describe the resulting phenotypes, we also intended to shed more light on the mechanistic side of environmentally induced phenotypic modifications using DNA methylation analysis. Although molluscs represent one of the most diverse taxa within the metazoan and are found in many different habitats, our knowledge of the DNA methylation in molluscs is scarce. Therefore, we aimed at deepening and summarizing our understanding about DNA methylation in molluscs. Publicly available molluscan genomic and transcriptomic data of all eight mollusc classes was downloaded to search for DNA methyltransferases (DNMTs 1-3) responsible for DNA methylation. Additionally, we estimated the normalized CpG dinucleotide content (CpG o/e) indicating the presence/absence and the frequency of DNA methylation in the genome. The CpG o/e ratio refers to the level of DNA methylation in the genome. Based on the sensitivity of methylated cytosines to mutate into thymine residues, species having a high germline methylation in genomic regions over evolutionary time, also have a lower CpG content, which is called CpG depletion. In contrary, species with a limited germline methylation in genomic regions over evolutionary time, show a higher CpG content and lack CpG depletion. The presence or absence of CpG depletion can be calculated with the CpG o/e ratio. Ultimately, the goal of our analyses was to gain insight into the evolution of methylation in molluscs. We detected DNMTs in all eight mollusc classes and in most of the species. It is therefore plausible that the last common ancestor of molluscs has already had the enzymatic machinery which is needed for DNA methylation. However, various species did not possess the complete DNMT toolkit indicating evolutionary modification in DNA methylation. In general, we found a wide distribution of the bimodal CpG o/e pattern in six mollusc classes, resulting from CpG depletion. The genes in these groups seem to be divided into genes with a high degree of methylation and genes with a lower degree of methylation. This implies that DNA methylation seems to be rather common in molluscs. Species of Solenogastres and Monoplacophora were not or only sparsely methylated. It seems that those mollusc groups have undergone a reduction in DNA methylation. We hope that our investigations will demonstrate the lacking knowledge in epigenetics of molluscs and encourage scientist to execute and continue genetic studies on molluscs.Die zunehmenden Umweltveränderungen, die in erster Linie auf anthropogene Einflüsse zurückzuführen sind, wirken sich auf Organismen auf dem gesamten Planeten aus. Im Allgemeinen unterscheiden Wissenschaftler zwischen drei verschiedenen Arten, wie Organismen auf Umweltveränderungen in ihrem Lebensraum reagieren können: Aussterben, Abwanderung und Anpassung. Ein Beispiel für Organismen, die sehr anpassungsfähig sind und sich leicht an neue und sich verändernde Umgebungen anpassen können, sind invasive Arten, die in der Lage sind, neue Lebensräume mit nur wenigen Individuen zu besiedeln. Um in ihrer neuen Umgebung erfolgreich zu überleben, passen sich invasive Arten schnell an neue abiotische und biotische Parameter an, z. B. an unterschiedliche Temperaturregimes. Phänotypische Plastizität ermöglicht es Organismen, ihren Phänotyp schnell an neue Umweltbedingungen anzupassen und erklärt den Anpassungserfolg invasiver Arten. Die Mechanismen, die der phänotypischen Plastizität zugrunde liegen, sind zwar noch nicht vollständig geklärt, ein möglicher "Motor" der phänotypischen Plastizität ist jedoch die Epigenetik. Insbesondere die DNA-Methylierung könnte die raschen Veränderungen des Phänotyps eines Organismus bei Veränderungen der Umwelt aufgrund von Plastizität erklären, wie es bei invasiven Arten der Fall ist. Die DNA-Methylierung könnte sogar zur Anpassung invasiver Arten durch phänotypische Plastizität beitragen, vor allem bei klonal reproduzierenden Arten. Methoden wie Common Garden Experimente mit klonal reproduzierenden Arten sind ein nützliches Instrument zur Unterscheidung zwischen phänotypischer Plastizität und genetischer Anpassung, da die unübersichtlichen Effekte der genetischen Variation bei klonal reproduzierenden Arten geringer sind. Unser übergeordnetes Ziel war es, das genetische Anpassungspotenzial von europäischen Populationen der Neuseeländischen Zwergdeckelschnecke (NZMS) (Potamopyrgus antipodarum) zu untersuchen, da diese nach ihrer Besiedlung Europas vor nur 180-360 Generationen einen extremen genetischen Flaschenhals (engl. „genetic bottleneck“) durchliefen. Offenbar wurde Europa von zwei verschiedene klonale Linien der NZMS kolonisiert, da zwei 16 s rRNA- und Cytochrom b-Haplotypen in verschiedenen europäischen Ländern gefunden wurden, die Haplotypen t und z. Die NZMS ist eine äußerst erfolgreiche invasive Art, die heute fast auf der ganzen Welt verbreitet ist. Die Schalen der NZMS weisen eine Lebensraum-abhängige, hohe Variabilität auf. Zudem sind sie ein fitnessrelevantes Merkmal. Die hohe Variabilität der Schalenmorphologie ist sowohl auf genetische Variation als auch auf phänotypische Plastizität zurückzuführen. Um die genetischen und die Umwelteinflüsse auf die Schalenmorphologie der NZMS zu trennen, führten wir ein Common Garden Experiment durch. Wir hielten sich asexuell fortpflanzende Weibchen aus elf europäischen Populationen in Klimaschränken mit drei verschiedenen Temperaturen, um Nachkommen zu produzieren. Mit Hilfe der geometrischen Morphometrie verglichen wir Größe und Form der Schalen über drei Generationen hinweg. Darüber hinaus schätzten wir Reaktionsnormen, maternale Effekte, die „broad-sense“ Heritabilität, den Koeffizienten der genetischen Variation (CVA) und die Evolvierbarkeit (IA) der Schalengröße und -form unter verschiedenen Temperaturbedingungen. Außerdem untersuchten wir die Reproduktionsrate der Elterngeneration. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die Schalenmorphologie der Elterngeneration zwischen den Populationen unterschied. Im Gegensatz dazu ähnelten sich die Schalenmorphologie der Töchtergenerationen immer mehr. Die Reaktionsnormen der F1-Generation zeigten sich bei den drei Temperaturen recht unterschiedlich. Wir konnten jedoch ein vom Haplotyp abhängiges Muster bei den Reaktionsnormen feststellen, was auf eine begrenzte genetische Differenzierung unter den europäischen NZMS deutet. Wir berechneten hohe Heritabilitätswerte für die Schalengröße, was auf einen hohen genetischen Einfluss hinweist. Die Heritabilitätswerte für die Schalenform waren niedriger als für die der Schalengröße. Im Allgemeinen variierte die Heritabilität in Abhängigkeit von der Temperatur leicht. Die Schalengröße schien eine höhere Evolvabilität zu haben als die Schalenform. Die Werte aller unserer Berechnungen waren jedoch sehr niedrig, was darauf hindeutet, dass die europäischen NZMS-Populationen eine geringe genetische Variabilität besitzen. Die Reproduktionsrate der Elterngeneration wurde eher vom Haplotyp als von der Temperatur beeinflusst. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass die NZMS in der Lage ist, ihre Schalenmorphologie plastisch an verschiedene Temperaturen anzupassen, wobei es signifikante Unterschiede zwischen den beiden Haplotypen gab. Dennoch deuten die niedrigen Werte für die Evolvierbarkeit darauf hin, dass sich seit der Ankunft der NZMS in Europa nur eine geringe genetische Variabilität herausgebildet hat, so dass es scheint, dass die europäischen NZMS nur begrenzt auf Selektion reagieren kann. Unsere Ergebnisse deuten außerdem darauf hin, dass die phänotypische Plastizität für die Anpassung an unterschiedliche Umweltbedingungen bei den NZMS und möglicherweise auch bei anderen Molluskenarten wichtig ist. Da klassische experimentelle Ansätze nur die resultierenden Phänotypen beschreiben können, haben wir eine Analyse der DNA-Methylierung durchgeführt, um auch die mechanistische Seite der umweltbedingten phänotypischen Veränderungen näher zu beleuchten. Obwohl Mollusken eines der vielfältigsten Taxa innerhalb der Metazoen darstellen und in vielen verschiedenen Lebensräumen vorkommen, ist unser Wissensstand über ihre DNA-Methylierung nur gering. Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, unsere Kenntnis über die DNA-Methylierung bei Mollusken zu vertiefen und zusammenzufassen. Öffentlich zugängliche genomische und transkriptomische Daten aller acht Molluskenklassen wurden heruntergeladen, um nach DNA-Methyltransferasen (DNMTs 1-3) zu suchen, die für die DNA-Methylierung verantwortlich sind. Zusätzlich schätzten wir den normalisierten CpG-Dinukleotidgehalt (CpG o/e), der das Vorhandensein/die Abwesenheit und die Häufigkeit der DNA-Methylierung im Genom anzeigt. Das CpG o/e-Verhältnis bezieht sich auf den Grad der DNA-Methylierung im Genom. Da methylierte Cytosine häufiger zu Thyminrückständen mutieren, haben Arten, die im Laufe der Evolution eine hohe Keimbahnmethylierung in Genomregionen aufweisen, auch einen geringeren CpG-Gehalt, was als CpG-Verarmung (engl. „CpG depletion“) bezeichnet wird. Im Gegensatz haben Arten, die eine geringe Keimbahnmethylierung in genomischen Regionen im Laufe der Evolution hatten, einen höheren CpG-Gehalt und keine CpG-Verarmung auf. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von CpG-Verarmung lässt sich anhand des CpG o/e-Verhältnisses berechnen. Letztendlich war das Ziel unserer Analysen, einen Einblick in die Evolution der Methylierung bei Mollusken zu gewinnen. Wir haben DNMTs in allen acht Molluskenklassen und in den meisten Arten nachgewiesen. Es ist daher plausibel, dass der letzte gemeinsame Vorfahre der Mollusken bereits über die enzymatische Maschinerie verfügte, die für die DNA-Methylierung erforderlich ist. Einige Arten besaßen jedoch nicht den kompletten DNMT-Baukasten, was auf eine evolutionäre Veränderung der DNA-Methylierung hindeutet. Im Allgemeinen fanden wir eine weite Verteilung der CpG-Verarmung in sechs Molluskenklassen. Die Gene in diesen Gruppen scheinen in Gene mit einem hohen Methylierungsgrad und Gene mit einem niedrigeren Methylierungsgrad unterteilt zu sein. Dies lässt darauf schließen, dass DNA-Methylierung bei Mollusken recht häufig vorkommt. Arten der Solenogastren und Monoplacophoren waren nicht oder nur spärlich methyliert. Es scheint, dass diese Molluskengruppen einen Rückgang der DNA-Methylierung erfahren haben. Wir hoffen, dass unsere Untersuchungen das fehlende Wissen über die Epigenetik von Mollusken aufzeigen und Wissenschaftler dazu ermutigen, genetische Untersuchungen an Mollusken durch- und fortzuführen