Estudio de fragmentos solubles de la proteína precursora amiloide como biomarcadores en la enfermedad de alzheimer

La Enfermedad de Alzheimer (AD), la forma más común de demencia senil, es un trastorno neurodegenerativo progresivo de etiología multifactorial que suele tener una duración media de 10 años tras el diagnóstico. Se caracteriza por la formación de depósitos proteináceos extracelulares (placas amiloides) e intracelulares (ovillos neurofibrilares). Las placas amiloides son depósitos extracelulares compuestos principalmente por el péptido ß-amiloide (Aß); mientras que los ovillos neurofibrilares son agregados intracelulares formados por una forma hiperfosforilada de la proteína citoesquelética tau (P-tau). Así, la AD es una tauopatía entre otras, pero es la única que cursa con placas amiloides, fenómeno más específico de esta patología. Aß es uno de los fragmentos proteolíticos generados por el procesamiento de una glicoproteína transmembrana denominada proteína precursora amiloide (APP), a través de la acción sucesiva de dos enzimas proteolíticas, ß- y ¿-secretasa. La APP también puede ser procesada por ¿-secretasa, iniciando una vía no amiloidogénica que no produce Aß; así como por otras secretasas, como la ¿-secretasa, que actúan de manera alternativa sobre APP en condiciones fisiológicas generando distintos tipos de fragmentos. Se entiende que en la patología de la AD subyace un desequilibrio entre los procesamientos alternativos de la APP que coexisten en condiciones fisiológicas. La APP también es objeto de distintas modificaciones postraduccionales que en parte pueden determinar su ulterior procesamiento por una vía u otra, entre ellas destaca la glicosilación. La glicosilación es un proceso de modificación co- y postraduccional consistente en la adición de un glúcido a una proteína, y que desempeña un papel crítico en muchas actividades celulares. Existe una evidencia creciente sobre la existencia de glicoproteínas con glicosilación alterada en el cerebro de sujetos con la AD, lo que puede evidenciar alteraciones en la funcionalidad de dichas glicoproteínas y contribuir a la patología. Por lo tanto, una investigación detallada de los procesos de glicosilación podría ser clave para la comprensión de la patogénesis de la AD, así como para el desarrollo de métodos diagnósticos y aproximaciones terapéuticas novedosas. Actualmente, el diagnóstico de la AD se basa en datos clínicos con el soporte de pruebas complementarias. El uso de biomarcadores resulta fundamental para avanzar en el diagnóstico precoz y dar certeza al diagnóstico clínico. Los biomarcadores del CSF más ampliamente estudiados han sido T-tau (tau total) y P-tau, que se encuentran elevados en el CSF de pacientes con la AD respecto a controles sanos, aunque su especificidad es insuficiente, ya que también aumentan en otras tauopatías y otros desordenes neurodegenerativos; y la forma del péptido Aß, Aß42, que paradójicamente aparece disminuido en el CSF. Se entiende que esta disminución en el CSF puede deberse a su secuestro en placas, dificultando su uso como biomarcador temprano. Por todo ello, se han propuesto como biomarcadores alternativos otros fragmentos derivados de la proteólisis de APP, y en esa posibilidad centramos esta tesis. En primer lugar, tratamos de caracterizar y determinar los niveles en el CSF humano de los fragmentos solubles del ectodominio de APP producto tanto del procesamiento amiloidogénico, sAPPß, como del no amiloidogénico, sAPP¿; así como de la forma sin procesar proteolíticamente (sAPPf), recientemente descrita en el CSF por nuestro grupo. El análisis se realizó en una colección de CSF de pacientes con la AD y controles sin la enfermedad, caracterizados por la determinación de los biomarcadores clásicos de la AD como son Aß42, T-tau y P-tau. Mediante separación electroforética, análisis por western blot, y utilización de anticuerpos específicos para el extremo resultante del procesamiento por ¿- o ß-secretasa de la APP, caracterizamos, tanto para sAPP¿ como para sAPPß, especies de alrededor de 100 y 120 kDa. Estas especies se podrían corresponder con las formas resultantes de las variantes de APP neuronales, APP695, y variantes más largas portadoras del dominio proteico denominado KPI (Kunitz-type protease inhibitor), expresadas normalmente en células gliales. Ninguna de estas especies mostró cambios en sus niveles, ni para sAPP¿ ni para sAPPß, en sujetos con la AD al ser comparados con controles. Sí se detectaron diferencias entre sujetos con la AD y controles cuando los niveles de las especies de 100 y 120 kDa se determinaron con un anticuerpo contra la región C-terminal de APP, que permite determinar sAPPf, o con un anticuerpo contra el dominio KPI, para determinar las formas sAPP-KPI. Aunque los niveles absolutos de estas formas de 100 y 120 kDa no mostraron diferencias significativas en la comparación directa entre los sujetos con la AD y los controles, la proporción de las mismas sí reveló diferencias que podrían indicar alteraciones en la expresión y/o procesamiento proteolítico. Los niveles de los fragmentos proteolíticos sAPP¿ y sAPPß, también fueron determinados en extractos cerebrales de corteza frontal de sujetos con confirmación histopatológica de la enfermedad. De manera semejante a lo observado en el CSF, no encontramos diferencias significativas entre los niveles de fragmentos sAPP¿ y sAPPß, determinados por western blot, en extractos cerebrales de sujetos con la AD al compararlos con los controles. Además, este estudio lo extendimos al análisis de la glicosilación mediante la interacción de estas especies con diferentes lectinas. En primer lugar, las especies de 100 kDa (derivadas probablemente de la APP-695, mayormente neuronal) mostraron glicosilación diferencial frente a las de 120 kDa (derivadas de especies APP-KPI, mayormente de origen glial), posiblemente reflejando el distinto origen celular. Resultó más interesante constatar diferencias en la glicosilación entre las especies sAPP¿ y sAPPß, lo cual puede indicar que ciertas glicoformas se procesan proteolíticamente por una vía preferencial. Finalmente, también observamos diferencias significativas en el patrón de glicosilación de la sAPP¿ al comparar extractos de sujetos con la AD con controles, lo que demostraría alteraciones en la glicosilación asociadas a la condición patológica. Por último, en esta memoria también están incluidos los estudios sobre la determinación de pequeños fragmentos C-terminales de APP (CTFs; asociados en principio a membrana) en el CSF, para explorar su potencial empleo como biomarcadores alternativos. Entre las distintas bandas inmunoreactivas a anticuerpos generados contra la región C-terminal de APP, en todos los casos, distinguimos como la forma mayoritaria una especie de unos 25 kDa, compatible por tamaño con el CTF resultante del procesamiento proteolítico de la APP por la ¿-secretasa (CTF¿). Los niveles de este APPCTF de 25 kDa fueron superiores en muestras de CSF de sujetos con AD genético determinado por la presencia de mutaciones en el gen de la presenilina-1 (PSEN1), y pacientes dementes con síndrome de Down (trisomía en cromosoma 21 que incluye el gen APP), respecto a sus controles de edad pareada. El APP-CTF de 25 kDa también se encontró aumentado en el CSF de sujetos con AD esporádico al ser comparados con controles de edad pareada