Caratterizzazione strutturale e funzionale dei geni che codificano per l’inibitore proteico delle poligalatturonasi in riso e frumento

Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetaliLe PGIP sono delle proteine inibitrici delle poligalatturonasi presenti sulla parete cellulare delle piante mono e dicotiledoni, e sono implicate nei meccanismi di difesa della pianta. Le PG sono enzimi idrolitici che vanno ad agire sul legame α1-4 tra due residui di acido galatturonico presente nella catena di omogalatturonano della componente peptica della parete cellulare, determinando la separazione cellulare e la macerazione del tessuto. La loro attività costituisce un fattore di patogenicità per diversi microrganismi patogeni. Le PGIP interagendo con le PG ne rallentano l’attività idrolitica e promuovono l’accumulo di oligogalatturonidi che fungono da elicitori delle risposte di difesa della pianta. L’efficienza della PGIP è stata dimostrata in piante transgeniche dove, la sua sovraespressione è stata correlata con una diminuzione dei sintomi conseguenti all’infezione da parte di Botritis cinerea, in più specie vegetali quali, vite, Arabidopsis, pomodoro e tabacco, e recentemente in frumento in seguito ad infezione con Bipolaris sorokiniana. Le PGIP nelle dicotiledoni sono state ampiamente caratterizzate, mentre nelle monocotiledoni sono state caratterizzate in porro e cipolla. In frumento sono state purificate due proteine che presentano attività nei confronti di PG fungine, ma posseggono una sequenza N-terminale diversa dalle canoniche PGIP purificate o dedotte dalle sequenze geniche. In riso non è stata purificata la PGIP, ma è stato isolato un gene il cui prodotto proteico, l’OsFOR1 possiede attività PGIP ed è coinvolto nello sviluppo degli organi fiorali. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di caratterizzare sia a livello strutturale che funzionale la famiglia genica PGIP in riso e frumento. Tramite analisi in silico associate ad analisi PCR, sono stati isolati quattro geni Pgip nel riso (Ospgip1, Ospgip2, Ospgip3, Ospgip4), distribuiti su una regione di 30 Kbp sul braccio corto del cromosoma 5, e due in frumento (la Tapgip1 e la Tapgip2) che, tramite PCR su linee nullitetrasomiche di Chinese Spring ed analisi Southern effettuate su linee ditelosomiche della cv. Langdon, sono stati localizzati rispettivamente sul braccio corto del cromosoma 7B e 7D. Tramite esperimenti di Southern blot effettuati su T. uratu (genoma AA) e parziale sequenziamento di due BAC di T. durum cv. Langdon è stato dimostrato che anche il genoma A contiene un gene Pgip (Tapgip3) interrotto da un retrotransposone Ikeros inserito nel 4º LRR, e che la Tdpgip1 e Tapgip3 sono presenti in singola copia. Tramite analisi PCR effettuate su genotipi diploidi e poliploidi è stato dimostrato che il retrotransposone inserito nel gene Pgip3 di T. urartu (AA), è presente anche nei frumenti polipoidi ma è assente nella Pgip3 di T. monococcum. Questi risultati stanno ad indicare che l’inserzione è avvenuta dopo la divergenza di T. urartu e T. monococcum, e prima della formazione dei poliploidi. Oltre al retrotrasposone che interrompe la Pgip3 sono stati identificati in due accessioni di T. dicoccoides MG4343 e PI466960 altri due elementi trasponibili di classe II nella Tdipgip1, che sono stati chiamati Vacuna. I due trasposoni rappresentano nuovi elementi appartenenti alla super famiglia Mutator che interrompono la regione codificante della Tdpgip1 in differenti posizioni, stando ad indicare che si tratta di eventi indipendenti di inserzione. La presenza di questo transposone nel genotipo MG4343 di T. dicoccoides ci ha permesso di mappare la Pgip1sul braccio corto del cromosoma 7B a 17,5 cM dal centromero. Effettuando analisi RT-PCR è stato dimostrato che i geni Pgip di riso sono espressi differentemente in foglie, spighe, radici, mentre la Tapgip1 e Tapgip2 di frumento sono espressi costitutivamente nei tessuti analizzati. Tramite RT-PCR quantitativa è stato anche dimostrato che i geni Tapgip1 e Tapgip2 di frumento vengono indotti a seguito di infezione da patogeni quali B. sorokiniana e Fusarium graminearum. L’espressione eterologa in Nicotiana benthamiana dell’OsPGIP1 mediante PVX ha permesso di determinare la sua attività inibitoria. Pur mancando del 7º LRR, l’OsPGIP1 mostra attività inibitoria verso 4 delle 5 PG saggiate, dimostrando che la mancanza di questo modulo non è essenziale per l’attività inibitoria. Poiché gli esperimenti di espressione eterologa della Tapgip in N .benthamiana non hanno prodotto la proteina, sono state effettuate delle trasformazioni stabili della Tapgip2, bombardando gli embrioni immaturi della cv. Svevo di frumento duro. Analisi preliminari effettuate sulle piantine in generazioneT0 mostrano la presenza del trascritto Tapgip2.Polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) are leucine-rich repeat (LRR) proteins involved in plant defence. A number of PGIPs have been characterized from dicot species, whereas only a few data are available from monocots. Database searches and genome-specific cloning strategies allowed the identification of four rice (Oryza sativa L.) and three wheat (Triticum aestivum L.) Pgip genes. The rice Pgip genes (Ospgip1, Ospgip2, Ospgip3 and Ospgip4) are distributed over a 30 Kbp region of the short arm of chromosome 5, whereas the wheat Pgip genes, Tapgip1, Tapgip2 and Tapgip3, are localized on the short arm of chromosome 7B, 7D and 7A, respectively. By Southern blots and sequence analysis of BAC clones we demonstrated that wheat contains a single copy Pgip gene per genome and the one from the A genome, Tapgip3, is inactivated by the insertion of a LTR copia retrotranspon within the fourth LRR. We demonstrated also that this retrotransposon insertion is present in T. urartu and all the polyploidy wheats assayed, but is absent in T. monococcum (Tmpgip3), suggesting that this insertion took place after the divergence between T. monococcum and Triticum urartu, but before the formation of the polyploid wheats. We identified also two independent insertion events of new Class II transposable elements, Vacuna, belonging to the Mutator superfamily, that interrupted the Tdipgip1 gene of T. turgidum ssp. dicoccoides. The occurrence of these transposons within the coding region of Tdipgip1 facilitated the mapping of the Pgip locus in the pericentric region of the short arm of chromosome group 7. Deduced amino acid sequences of both OsPGIP and TaPGIP show the typical LRR modular organization and a conserved distribution of the eight cysteines at the N- and C- regions. Sequence comparison suggests that monocot and dicot PGIPs form two separate clusters sharing about 40% identity and shows that this value is close to the extent of variability observed within each cluster. Gene-specific RT-PCR and biochemical analyses demonstrate that both Ospgips and Tapgips are expressed in the whole plant or in a tissue-specific manner, and that OsPGIP1, lacking an entire LRR repeat, is an active inhibitor of fungal polygalacturonases. This last finding can contribute to define the molecular features of PG-PGIP interactions and highlights that the genetic events that can generate variability at the Pgip locus are not only limited to substitutions or small insertions/deletions, as so far reported, but can also involve variation in the number of LRRs. Finally, on the basis of the presence of PGIP activity in T. dicoccoides genotypes having both inactive Tapgip genes we speculate that their inactivation is tolerated because of redundancy of PGIP activities in the wheat genome