Auxin is involved in the plant response to simulated space conditions: neutron radiation and microgravity

Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimicaNotevoli sono gli interessi della comunità scientifica internazionale rivolti verso la possibilità di poter germinare e crescere le piante a bordo di stazioni spaziali. Attualmente i progetti spaziali dedicati alla ricerca biologica sono volti a studiare gli effetti delle componenti che caratterizzano lo spazio, quali: microgravità, radiazioni cosmiche, bassa pressione atmosferica, elevata CO2 ed elevate escursioni termiche. Scopo di questo lavoro è di chiarire alcuni dei quesiti ancora poco chiari sugli effetti e le risposte delle piante a due particolari componenti dell’habitat spaziale: microgravità e radiazioni neutroniche. Il primo problema affrontato in questo lavoro è stato di chiarire gli effetti delle radiazioni spaziali di tipo ionizzante che non vengono schermate e che giornalmente sono assorbite a bordo dei vettori spaziali. Questo comporta, per l’astronauta, un costante aumento del rischio di malattie degenerative, quali il cancro, con effetto anche ereditario. Pur considerandone la rilevanza scientifica e applicativa, è comunque ancora scarsa la letteratura relativa agli effetti delle radiazioni spaziali sulle piante. Fattore limitante per tali sperimentazioni è probabilmente l’esiguo numero di voli spaziali a disposizione per ripetere esperimenti che abbiano come soggetto organismi vegetali. I neutroni si differenziano dalle altre particelle secondarie per l'assenza di carica elettrica. Nell’ampio spettro delle radiazioni presenti nello spazio, i neutroni proprio per la loro natura rappresentano un serio problema sia per la salute degli astronauti che per ogni altro organismo, a causa della facilità con la quale essi attraversano le barriere e le schermature, producendo infine una vasta gamma di effetti negativi. In questo lavoro, l’attenzione è stata concentrata sullo studio dell’effetto della radiazione neutronica su quei geni attivati dal fitormone auxina, che controlla in larga misura i processi morfogenetici nelle piante, e, allo stesso tempo, sui geni coinvolti nell’attivazione dei sistemi di difesa da stress e della senescenza. Il profilo di espressione, dopo irraggiamento con 50 mGy di neutroni, dei geni appartenenti alla famiglia ARF (ARF1, ARF2 e ARF19), noti per controllare aspetti significativi della morfogenesi e dello sviluppo della pianta, hanno mostrato una inibizione rispetto ai controlli non trattati, mentre dei geni della famiglia AUX/IAA (AUX/IAA3, AUX/IAA6, AUX/IAA7), considerati essere coinvolti in molti dei processi cellulari, solo AUX/IAA7 era indotto. Lo stesso gruppo di geni, è stato studiato nei due mutanti di trasporto dell’auxina aux1 e eir1. Il risultato di tale indagine ci ha mostrato una situazione completamente diversa rispetto al wilde-type: i geni ARF erano sovra-regolati, mentre AUX/IAA7 era indotto in aux1, ma inibito in eir1. Quindi, sembrerebbe che i disturbi nel trasporto auxinico inducano variazioni nell’espressione dei geni ARF ed AUX/IAA7 in entrambi i mutanti aux1 ed eir1. È stato poi osservato che i geni coinvolti nella senescenza SAG12 e SAG13 erano sovra-regolati nel wild-type. Comunque, anche in questo caso, è stato osservato un andamento invertito nel mutante aux1, in cui entrambi i geni SAG12 e SAG13, erano sotto-regolati, mentre in eir1 l'effetto era simile a quello riscontrato nel wilde-type. Questo risultato suggerisce un coinvolgimento del trasporto dell’auxina nell’accelerazione della senescenza. Inoltre, in piante selvatiche, i geni responsabili della sintesi delle catalasi CAT1 e CAT3 e Fe-superossido dismutasi 1, mostrano un aumento dei livelli di espressione dopo trattamento con radiazioni neutroniche. Questo risultato è coerente con l'accelerazione dei processi di senescenza e stress indotti dalle radiazioni. Tuttavia, anche i geni che controllano i processi ossidativi erano inibiti nei mutanti aux1 e eir1. In aggiunta, dopo 20 giorni dal trattamento, entrambi i geni SAG12 e SAG13 mostravano ancora una consistente sovra-espressione in piante wild-type, mentre nei mutanti arf1-3 ed eir1 i loro livelli trascrizionali erano bassi, pur rimanendo significativamente più alti di quelli misurati nei rispettivi controlli. Il caso più interessante è tuttavia rappresentato dal mutante arf2-6, in cui i geni attivati dalla senescenza erano chiaramente sotto-regolati, mostrando in aggiunta, un forzato stato giovanile della pianta, pur considerando la sua già tardiva senescenza. I dati raccolti dopo 4 settimane dall'irradiazione, suggeriscono effettivamente un’accelerazione della senescenza, sia in piante selvatiche che in differenti mutanti auxinici (come eir1 ed arf1-3). Il gene ARF2 è controllato dall’auxina nella sua attività ed è noto che la sua mutazione innesca un ritardo dell’invecchiamento della pianta. I risultati ottenuti suggeriscono contributo del fattore ARF2 nella risposta della pianta alle particolari condizioni dell’ambiente spaziale, quantomeno nel caso della radiazione neutronica e della microgravità. Ulteriori indagini di manipolazione di questo gene potrebbero quindi rivelarsi utili nella produzione di piante adatte ai voli spaziali. Secondo obiettivo di questo lavoro era quello di studiare il ruolo dell’auxina nella risposta delle piante alla microgravità. Le piante possono orientare la loro direzione di crescita in risposta alla gravità. Questo fenomeno viene indicato come risposta gravitropica (o gravitropismo). Gli statoliti, nelle cellule della columella, e le endomembrane del reticolo endoplasmatico (ER) sembrano essere coinvolte nella percezione della gravità. Prove sperimentali attribuiscono anche al citoscheletro un ruolo importante nel rilevare lo stimolo gravitropico. In particolare, è stato osservato che bloccando la polimerizzazione dei filamenti di actina si ha un’alterata risposta gravitropica. Cholodny e Went, lavorando indipendentemente, proposero che la ridistribuzione di una sostanza prodotta dalla pianta fosse responsabile dell’attivazione della crescita cellulare differenziale, come risposta fototropica. Successivamente, numerose prove sono state prodotte a supporto di come l’auxina abbia un ruolo anche nella risposta gravitropica: a) l’applicazione asimmetrica di auxina induce la curvatura, sia dei germogli che delle radici; b) gli inibitori del trasporto auxinico inibiscono la curvatura dell’apice radicale; c) IAA marcato si accumula lungo gli organi gravistimolati. L’auxina viene trasportata per diffusione passiva e mediante un trasporto attivo polare asimmetrico. Quest’ultimo viene mediato da due famiglie di proteine. I trasportatori responsabili dell’efflusso dell’auxina dalla cellula sono le proteine PIN-FORMED, mentre quelle responsabili dell’afflusso di auxina verso la cellula sono le proteine AUXIN1/LIKE. Ulteriori prove a conferma del coinvolgimento dell’auxina nelle risposte gravitropiche sono state recentemente fornite da esperimenti di microgravità simulata (utilizzando clinostati 3-D, ovvero Random Positioning Machine, RPM), studiandone la risposta nei mutanti aux1 e eir1/pin2/agr1. Il meccanismo di azione dell’auxina è regolato da repressori ed attivatori trascrizionali di geni bersaglio che rispondono alla variazione di concentrazione di IAA. Tali fattori appartengono a due famiglie di proteine: gli ARF (fattori di risposta all’auxina), che attivano l’espressione dei geni di risposta all’auxina; e gli AUX/IAA, inibitori dei geni regolati dall’auxina. Nelle piante, sia fattori endogeni che ambientali regolano i processi fisiologici, e l’auxina risulta quindi essere la chiave di avvio di molti di tali processi: germinazione e sviluppo, fioritura e senescenza. Inoltre, è noto che l’auxina reprime la trascrizione di alcuni geni la cui espressione è correlata con la senescenza. Nell’ultimo decennio, numerosi sono stati gli esperimenti condotti nello spazio, con lo scopo di studiarne l’effetto sullo sviluppo e la crescita nelle piante. La risposta di una pianta esposta all’assenza di gravità (o microgravità) si riflette in cambiamenti fisiologici, cellulari e biochimici di diversa intensità ed in organi diversi. Anche i movimenti della radice primaria delle piante sembra essere alterato dalla microgravità. Obiettivo del corso di dottorato era quello di investigare l’effetto della microgravità simulata su due differenti mutanti nel trasporto dell’auxina, e indagare dopo microgravità il mantenimento del bilanciamento tra polimerizzazione e depolimerizzazione delle componenti di microtubuli e microfilamenti presenti nel citoscheletro cellulare. È noto che i microtubuli (MT) hanno un importante ruolo funzionale nella cellula, principalmente nel contribuire alla corretta crescita della radice. I risultati dell’analisi quantitativa dei livelli di espressione di diversi geni deputati alla sintesi delle diverse unità costituenti i MT hanno evidenziato un’attivazione trascrizionale sia di α- e β-tubulina (TUA4, TUA6, TUB2) che della isoforma 8 dell’actina (ACT8) dopo sole tre ore di microgravità nelle piante WT ed un ritardo di tale attivazione nei due mutanti per il trasporto auxinico (induzione solo dopo 6 ore di trattamento). Questo risultato suggerisce una risposta tardiva alla microgravità simulata in piante con un difettoso trasporto dell’auxina. In aggiunta, la microgravità induceva un forte incremento dei livelli di β-tubulina in piante selvatiche dopo sei ore di RPM, mentre nei mutanti aux1 ed eir1 tale induzione è solo minima, già partendo, in condizioni di controllo, da valori più alti rispetto a quelli misurati nel WT. Questo dato, evidenziando un maggiore stato di alterazione del citoscheletro, avvalora ulteriormente l’idea che un difettoso trasporto dell’auxina possa, a livello cellulare, innescare stati di alterazione o di stress ed una tardiva risposta agli effetti della microgravità. L’analisi trascrizionale di due geni coinvolti nella risposta a stress ossidativo supporta tale ipotesi. I geni CAT3 e FeSOD1, sono indotti da microgravità simulata già dopo tre ore, mentre nei due mutanti auxinici non si osserva alcuna induzione di tali geni. Anche questo risultato è coerente con un ritardo nella risposta allo stress osservato nei mutanti aux1 ed eir1 rispetto al wild-type. Inoltre, misurazioni effettuate al microscopio a fluorescenza sulle radici primarie delle piante sottoposte a RPM hanno chiaramente evidenziato che, sebbene la microgravità induca uno stato di apoptosi, sia nella zona di allungamento che di divisione, in tutti gli ecotipi trattati, tale condizione di stress è più marcato nelle radici di aux1 ed eir1 che non in quelle di piante WT. In particolare, l’area più sensibile agli effetti della microgravità sembra essere la columella e la cuffia radicale, nota per la sensibilità al gravitropismo, e più precisamente la zona delle cellule quiescenti. Inoltre, è noto che le cellule nella zona quiescente hanno un elevato contenuto di auxina, e vengono anche definite cellule iniziali del trasporto auxinico. La sovrapposizione della putativa sede della percezione gavitropica con quella iniziale del trasporto auxinico, è coerente con i risultati da noi ottenuti, per i quali una risposta tardiva alla microgravità simulata si osserva nei mutanti per il trasporto auxinico; ed è proprio nelle radici primarie di questi mutanti che le cellule della columella mostrano il danno cellulare maggiore microgravità-indotto. In conclusione, se un’alterazione del vettore gravità è in grado di generare una reale condizione di stress ossidativo, in particolare nell’apparato radicale, l’auxina sembra essere coinvolta nella risposta a tale stress. Un difetto nel trasporto polare di tale ormone è infatti sufficiente ad inibire fortemente e ritardare la corretta attivazione dei meccanismi difensivi della pianta in risposta alla microgravità. In particolare, abbiamo dimostrato come un difetto nel trasporto dell’auxina si rifletta in un’alterazione della riorganizzazione delle fibre microtubulari del citoscheletro delle cellule soggette a microgravità, a suggerire un ruolo più ampio dell’auxina nella regolazione dei meccanismi di risposta alla gravità. Infine, i nostri risultati supportano l’idea che il gruppo di cellule della columella sia deputato ad essere sede della gravipercezione come anche del trasporto auxinico iniziale. Queste ipotesi sono anche supportate dall’ultima parte di questo lavoro, in cui è stato isolato e caratterizzato un nuovo mutante di Arabidopsis parzialmente agravitropico: rha1. RHA1, il gene responsabile della mutazione, sembra essere coinvolto nei processi connessi all'azione e trasporto dell’auxina e codifica per un heat-shock factor (HSF). Gli esperimenti effettuati sul mutante rha1 indicano un’alterata capacità gravitropica, ed inoltre una ridotta lunghezza dei germogli, della radice primaria, una diminuita distanza tra i nodi del fusto, una riduzione delle infiorescenze e del numero delle radici secondarie. Tali caratteristiche sono simili a quelle riscontrate in altri mutanti sia nel trasporto che nel metabolismo dell’auxina, in particolare, nei mutanti aux1 e axr4. Il mutante rha1 non sembra essere disturbato nella circumnutazione in se, nello slanting, come anche nel gravitropismo.Relevant is the interest of the International scientific community to the possibility of germinating and growing plants aboard the Space Stations. Actually, space projects on the biological research are focused on studying the effect of the components which characterize the space environment: microgravity, cosmic radiations, low atmospheric pressure, high CO2 and thermal range. Aim of this work was to answer to some of the not yet clarified questions regarding the plant response to microgravity and neutron radiation. Firstly, we focused our attention on the effects of the ionizing radiations, which are not shielded and are daily absorbed by the astronauts and other organisms on the space shuttles. Even if the scientific relevance of this phenomenon is high, the literature on the space radiations effect on plant is still minimal. One of the limiting factors to do and repeat experiments in this direction is probably the small amount of available space flights. Neutrons are different form the other secondary particles for the absence of the electric charge. This property allows them to easily cross the artificial barriers and shields, causing a of different negative effects. In this work, the attention was focused on the neutron effect on the genes either activated by the phyto-hormone auxin, which regulates the plant morphogenetic processes, or involved in the activation of plant senescence and defense system. The expression profile of three ARF genes (ARF1, ARF2, ARF19), which are known to regulate the main plant morphogenetic and development processes, as well as three AUX/IAA genes (AUX/IAA3, AUX/IAA6, AUX/IAA7), involved in different cell processes, was followed after treating wild-type Arabidopsis plants with 50 mGy of neutrons. The ARF genes were inhibited, and AUX/IAA7 was up-regulated after the treatment. The same expression profile carried out for two mutants defective for the auxin transport (aux1 and eir1), showed different results. In these mutants the ARF genes were up-regulated, while the AUX/IAA7 was either induced in aux1 or inhibited in eir1. It seems that a mutation in the auxin transport may allow a different regulation of the auxin response genes. It was also observed that the senescence related genes SAG12 and SAG13 were up-regulated in both wild-type and eir1 treated plants, but were inhibited in aux1. This result suggests an involvement of auxin transport system in the senescence. Moreover, neutrons induced an increased mRNA expression level of the genes responsible for the catalase biosynthesis (CAT1 and CAT3) and iron superoxide dismutase (FeSOD1), in the wild-type plants. This is consistent with the accelerated senescence and stress response mechanisms induced by radiation. However, the oxidative stress related genes were inhibited in both aux1 and eir1 mutants. In addition, 20 days after the treatment, both SAG12 and SAG13 genes were still highly overexpressed in the wild-type plants, when compared with controls. However, in the eir1 and arf1-3 mutants, these genes showed lower mRNA transcript level in comparison with the wild-type plants, but still higher than the measured levels in their respective controls. Interestingly, arf2-6 clearly showed a strong down-regulation of the senescence activated genes, also showing a increased juvenile developmental stage, even considering the delayed senescence of this mutant. Data collected 4 weeks after the neutron treatment, suggested an acceleration of the senescence mechanism, in the wild-type as well as in the auxin mutants eir1 and arf1-3. It is known that ARF2 is regulated by auxin and that its mutation allows a delay in the senescence activation. Our results support the hypothesis that ARF2 may help plants to better respond to the characteristic conditions of the space environment (e.g. neutron radiation, microgravity). Further investigation and manipulations on this gene may be useful to generate plants more suitable for the space flights. Another objective of this work was focused on the role of auxin in the plant response to microgravity. Plants orient the root growth direction in response to gravity. This phenomena is known as gravitropic response (or gravitropism). Statoliths, in the columella cells, as well as the endoplasmatic reticulum membranes seem to be involved in the gravitropic stimulus. Recent evidences ascribe to cytoskeleton an important role in plant detection of gravity. It was also shown that knocking down the actinic filaments polymerization allow an altered gravitropic response. Cholodny and Went independently suggested that the phyto-hormone auxin redistribution could be responsible for the differential cell growth, as well as for the phototropic response. Later, experimental evidence demonstrated the central role of auxin in the gravitropic response: a) asymmetrical application of auxin induced a curvature either in stem or in root tissue; b) auxin transport inhibitors inhibited the root apices curvature; c) labeled auxin was accumulated along the gravistimulated organs. Auxin is carried by passive diffusion or via an asymmetric polar active transport. The latter is mediated by two big families of proteins. The auxin efflux carriers are the PIN-FORMED proteins, and the auxin influx carriers are the AUXIN1/LIKE proteins. Moreover, involvement of auxin in the gravitropic response was recently confirmed by different experiments of simulated microgravity (using 3-D clinostats, or random positioning machine, RPM), on both aux1 and eir1/pin2/agr1 mutants. The mechanism by which auxin acts is regulated by transcriptional activators and repressors. The ARF proteins activate the expression of auxin response genes; and the AUX/IAA factors inhibit the transcription of auxin related genes. In plants, physiological processes are regulated by endogenous and environmental factors, and auxin seems to be the key regulator, like germination and development, flowering and senescence. Moreover, transcriptional activity of different senescence related genes is repressed by auxin. In the last years, many experiments were done to study the effect of space environment on plant development. Exposure of plants to reduced gravity conditions (microgravity), triggers physiological, cellular and biochemical alterations, with different patterns and in different organs. However, also the primary root movements seems to be altered by microgravity. One of the main aims of this work was to investigate the effect of simulated microgravity on two different mutants in auxin transport, and investigate the maintenance of balance between polymerization/de-polymerization of cellular microtubules (MT) and microfilaments. Microtubules play an central role into the cell, helping the root growth. Quantitative analysis of the mRNA transcript level of the genes responsible for the synthesis of the microtubule sub-unities, showed an up-regulation of both α- and β-tubulin (TUA4, TUA6, TUB2), and actin 8 (ACT8) 3 ours after the RPM treatment in the wild-type plants; while this transcriptional induction was delayed (6 h after the treatment) in the eir1 and aux1 mutants. This result suggested a slower response to microgravity of plants with a defective auxin transport, at least in the regulation between polymerization/de-polymerization of MT. Moreover, microgravity induced, in the wild-type plants, an increase of the β-tubulin protein level 6 h after the RPM treatment, while in the aux1 and eir1 mutants β-tubulin protein level was not significantly changed, if compared to those measured in the control plants. Our results reveals a higher state of alteration in the cytoskeleton of the aux1 and eir1 cells, supporting the hypothesis that a defective auxin transport could cause stress conditions, at cellular level, together with a delayed response to microgravity. Transcriptional analysis of the genes involved in the plant response to oxidative stress is in accordance with this idea. Microgravity induced the expression of both CAT3 and FeSOD1 genes just 3 h after the RPM treatment in the WT plants, while no differences in the transcript levels of these genes was observed in aux1 and eir1 mutants. This result is also consistent with the slower response to microgravity of the auxinic mutants, with respect to the WT plants. In addition, measurements of the apoptotic apical root cells were performed using a fluorescence microscope before and after the RPM treatment. Treated WT plants showed a higher number of apoptotic cells, if compared to the control, but this microgravity-induced stress condition was much more eviden