Mutagenesis for the development of novel wheats: modification of starch composition and improvement of nutritional value

Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetaliIl presente progetto di dottorato si inserisce in una linea di ricerca che punta al miglioramento delle caratteristiche tecnologiche e nutrizionali della farina di frumento attraverso la manipolazione genetica della composizione chimica dell’amido. L’amido è costituito da due polimeri glucanici, l’amilosio e l’amilopectina, che differiscono nella lunghezza delle catene e nel grado di ramificazione. La manipolazione del rapporto amilosio-amilopectina consente la produzione di amidi con nuove proprietà chimico-fisiche. É stato dimostrato che l’aumento della percentuale di amido resistente, riscontrata negli “amidi ad alto contenuto di amilosio” (HAS), apporta notevoli benefici alla salute umana , riducendo il rischio di importanti malattie quali il cancro, il diabete, l’osteoporosi. La strategia utilizzata per l’ottenimento di HAS consiste nella manipolazione delle vie biosintetiche dei due polimeri che costituiscono l’amido, l’amilosio e l’amilopectina. I due polimeri sono sintetizzati attraverso vie biosintetiche distinte che condividono lo stesso substrato; la mancanza di attività di due classi di enzimi coinvolte nella sintesi dell’amilopectina, SSII e SBEIIa, è stato associato, in frumento, a genotipi caratterizzati da un notevole incremento della percentuale di amilosio. In particolare il silenziamento dell’enzima SBEIIa, attraverso RNA interference, ha permesso di ottenere linee di frumento con amidi costituiti per il 70% da amilosio rispetto a circa il 25 % dei genotipi normali. Nel presente progetto di dottorato sono state generate nuove linee di frumento tenero caratterizzate dalla perdita di espressione degli alleli SBEIIa attraverso un approccio di genetica inversa basato sul TILLING. La prima parte di questo lavoro è consistito nell’isolamento e sequenziamento dei due omoeoalleli SBEIIa-A e SBEIIa-B di frumento tenero localizzati rispettivamente sul braccio corto dei cromosomi 2AS e 2BS. L’allineamento delle sequenze genomiche dei tre alleli ha inoltre evidenziato la presenza di diverse inserzioni transposon like; sono stati condotti esperimenti finalizzati allo studio del grado di conservazione di tali elementi in diversi frumenti diploidi e poliploidi. Mediante il confronto delle sequenze nucleotidiche dei tre omeoalleli sono state identificate regioni geniche adatte al disegno di oligonucleotidi genoma specifici utilizzati nelle amplificazioni PCR degli esperimenti di TILLING. L’analisi di una popolazione mutagenizzata di frumento tenero, cv Cadenza, ha portato all’identificazione di numerose varianti alleliche per ciascuno dei tre geni. In totale sono stati identificati 59, 14 e 49 nuove varianti alleliche , rispettivamente per gli alleli SBEIIa-A, SBEIIaB e SBEIIa-D. In particolare, per ciascuno dei tre omeologhi, sono state identificate due mutazioni deleterie responsabili delle perdita di espressione genica. Sono stati generati due genotipi caratterizzati dalla presenza di un codone di stop all’interno della regione codificante dell’allele SBEIIa-A; una mutazione in un sito di splicing e una non senso sono state identificate per ciascun dei due alleli SBEIIa-B e SBEIIa-D. L’analisi dei trascritti dell’allele del genoma A, nei due genotipi singoli nulli SBEIIa-A-, ha evidenziato una drastica riduzione dell’espressione del gene rispetto al genotipo wild type indicando l’intervento di un meccanismo di degradazione dell’RNA messaggero noto come NMD (Nonsense- Mediated RNA Decay). L’analisi della progenie M3 dei genotipi nulli SBEIIa, effettuata attraverso un saggio di tipo PCR-MAS (Marker Assisted Selection), ha permesso l’identificazione e la selezione di genotipi mutanti omozigoti. È stato avviato un programma di incrocio tra le linee nulli SBEIIa per la realizzazione di una “seria fenotipica” caratterizzata dalla riduzione o mancanza dell’enzima target e da diversi livelli di incremento del contenuto di amilosio. Inoltre sono stati ottimizzati i protocolli di diverse metodiche di analisi delle proprietà chimico fisiche dell’amido utilizzando linee di frumento ad alto e a basso contenuto di amilosio. Tali metodiche saranno utilizzate per l’analisi dell’amido dei genotipi nulli completi e parziali SBEIIa generati in questo lavoro.Reserve starch represents the main component in wheat endosperm whose composition strongly influences the quality and nutritional value of wheat-based food products. A new challenge to develop novel wheat varieties with improved quality characteristics has recently been identified through the manipulation of starch composition. Starch is composed by two glucan polymers different in chains length and branching grade.The modulation of amylose/amylopectin ratio greatly affects wheat flour nutritional and processing properties. Currently many efforts focus on the objective of increasing the amylose fraction in cereal starches. Higher amylose content correlates with an increased amount of “resistant starch”, a particular starch fraction, considered to have beneficial effects on human health lowering the risk of important diseases. Amylose and amylopectin are synthesized from a common substrate, ADP-glucose, by two distinct pathways. Amylose production involves one enzyme – Granule Bound Starch Synthase I (GBSSI)-whereas three classes of enzyme, known as starch synthases (SSs), branching (SBEs) and debranching enzymes (DBEs) take part to the synthesis of amylopectin. Starch branching enzymes IIa are one of the main targets to increase amylose content in cereals. Recent studies, in bread and durum wheat, have shown that the RNA interference technology can result efficiently in the loss of SBEIIa functionality, leading to a drastic change of the amylose/amylopectin ratio. The TILLING-Targeting Induced Lesions In Genomes-represents an effective reverse genetics tool for the production of novel allelic variants in valuable traits. In TILLING the combination of traditional chemical mutagenesis with high-throughput detection methods of point mutations has originated an attractive strategy both for functional genomics and breeding applications overcoming limits associated with transgenic issues. In this work an EMS mutagenised population of bread wheat has been analyzed for the identification of SNPs (single nucleotide polymorphisms) of interest in the three homoeoalleles SBEIIa located in A, B and D genomes by a TILLING approach. The two genes SBEIIa-A and SBEIIa-B have been isolated and sequenced and polymorphic regions have been selected in order to design allele specific primer pairs to be used in TILLING. The comparison of the three genes have led to the identification of several transposon like insertions. These elements have also been investigated in diploid and polyploid wheats in order to establish phylogenetic relationship. Several targeted regions of the three SBEIIa genes have been analyzed in approximately two thousand wheat lines by High Resolution Melting technology, based on the comparison of the melting behaviours of the amplified PCR fragments. Fifty nine mutant genotypes have been characterized for SBEIIa-A, fourteen for SBEIIa-B and forty nine for SBEIIa-D confirming a mutation frequency of 1 SNP for each 36kb associated to the TILLING library. Most of the mutations described are localized in the coding region. Worthy of note two deleterious mutations have been identified in each of the three SBEIIa homoeoalleles. Two nonsense mutation localized, respectively, in the exon IX and exon XII, have been identified for SBEIIa-A gene; one nonsense mutation and one affecting a splicing site, have been found for each of the two alleles SBEIIa-B and SBEIIa-D. For all three homoeologues different missense mutations, causing the change of conserved residues located in catalytic domains of SBEIIa enzymes, have been identified. Transcripts analysis of the two SBEIIa-A nonsense mutants revealed a drastic reduction of the gene expression compared to wild type genotype, indicating mRNA degradation by a NMD (Nonsense Mediated Decay) mechanism. SBEIIa-single null genotypes have been selected in the M3 progenies by a PCR-Marker Assisted Selection assay based on the development of dCAPS primers. Electrophoretic analyses carried out in the SBEIIa single null mutants of A and B genomes have not detected any changes in the starch granule proteins profile. Moreover in this work, methods for the characterization chemical physical properties of starch have been optimized using wheat lines with an altered amylose/amylopectin ratio. These methods will be used to characterize the SBEIIa of complete and partial null genotypes