Aplicação tópica de bioflavonóides em epiderme humana reconstruída in vitro usando nanopartículas lipídicas

Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente , 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA quercetina (QT) é um flavonóide com diversas atividades terapêuticas atribuídas principalmente às suas capacidades antioxidante, anti-inflamatória, anticancerígena, antienvelhecimento e antibacteriana. A sua aplicação no tratamento de doenças da pele está bem relatada. Contudo, devido à sua natureza lipofílica, fraca solubilidade e permeação cutânea reduzida, a aplicação tópica da QT fica comprometida. Para melhorar a permeabilidade e eficácia deste tipo de substâncias, atualmente são exploradas estratégias alternativas promissoras, como a incorporação em Nanostructured Lipid Carriers, NLCs. Estas partículas fornecem propriedades benéficas à aplicação tópica como o tamanho reduzido, grande área de superfície, capacidade de carga, estabilidade, reduzida toxicidade e libertação controlada do composto bioativo. As NLCs formuladas com Span 80 como surfactante (2%), ácido mirístico (C14:0) como lípido sólido e diversos óleos vegetais como lípido líquido (óleo de girassol (OG), azeite (OA), milho (OM), coco (OC) e rícino (OR)), nos rácios LS:LL=40:60, possuíam um tamanho médio entre 152 ± 8,2 nm (ORNLC) e 165 ± 2,5 nm (OC-NLC), potencial zeta de -54,6 mV (OG-NLC) a -60,1 mV (OC-NLC) e PDI < 0,3. A avaliação da estabilidade a longo prazo durante seis meses mostrou que para NLCs vazias, o tamanho de partícula diminuiu aproximadamente entre 5% (OR-NLC) e 42% (OC-NLC), com exceção de OG-NLC, para o qual foi observado um aumento de 20%. Posteriormente foram formuladas NLCs com 0,5% de QT incorporada (QT-NLCs), que apresentaram ao fim de seis meses um tamanho médio de partícula que variou entre 170 ± 3,4 nm e 236 ± 25,6 nm, apresentando uma diminuição entre 1% (OM-NLC) e 15% (OC-NLC), exceto para OR-NLCs para os quais foi observado um aumento de 2%. O potencial zeta foi inferior a -30 mV para garantir uma boa homogeneidade e estabilidade física das nanopartículas criadas a longo termo. O ponto de fusão do lípido sólido foi de 56,3ºC, de NLCs vazias variou entre 41,86 e 53,24ºC e de QT-NLCs variou entre 43,36 e 50,25ºC. O ponto de fusão para NLCs vazias e com QT foi inferior ao ponto de fusão do lípido sólido, o que demonstra que todas as formulações de NLCs observadas possuíam uma estrutura amorfa. A eficiência de incorporação da QT variou entre 99,90 e 99,99% e a capacidade de carga entre 16,65 e 16,66%, tendo sido encontrada uma libertação inicial controlada até às 8 horas, atingindo até 36% (OG-NLC) de libertação total até 72 horas. A encapsulação da QT diminuiu a citotoxicidade e aumentou o efeito antioxidante das nanopartículas. O estudo do efeito antioxidante revelou que os óleos vegetais e QT livre mantiveram a atividade antioxidante do composto bioativo. No caso das NLCs, comparando com os resultados obtidos com QT, detetou-se uma capacidade de eliminação de radicais livres entre 10% e 38% para NLCs vazias e entre 35% e 67% para QTNLCs. Assim, de forma geral, os sistemas mantiveram a arquitetura funcional da QT após o seu encapsulamento, o que é mostrado pelo elevado potencial antioxidante obtido. A permeação in vitro foi também estudada em modelos de epiderme humana reconstruída (RHE), tendose verificado que as NLCs formuladas foram capazes de permear a QT e que esta ficou essencialmente retida no stratum corneum. Foi detetada uma possível libertação e difusão de QT através das camadas mais profundas do modelo RHE. Em conclusão, apesar de ser importante a realização de mais estudos que comprovem a eficácia e segurança dos nanossistemas formulados, os resultados obtidos neste estudo constituem argumentos sugestivos para as nanopartículas lipídicas à base de óleos vegetais como uma estratégia promissora para a aplicação tópica da QT.Quercetin (QT) is one of the flavonoids with several therapeutic activities mostly attributed its antioxidant, anti-inflammatory, anticancer, antiaging, and antibacterial capacity. It’s application to treat skin disorders is well reported. However, due to its lipophilic nature, poor solubility and reduced skin permeation, topical application of QT is compromised. To improve the permeability and effectiveness of this type of substance, promising alternative strategies are currently being explored, such as incorporation into nanostructured lipid particles (NLCs). These particles provide beneficial properties for topical application such as reduced size, large surface area, load capacity, stability, reduced toxicity, and controlled release of the bioactive compound. The NLCs formulated with Span 80 as a surfactant (2%), myristic acid (C14:0) as solid lipid and several vegetable oils as a liquid lipid (sunflower (OG), olive (OA), corn (OM), coconut (OC) and castor oil (OR)), in the ratio SL:LL=40:60, have an average size between 152 ± 8,2 nm (OR-NLC) and 165 ± 2,5 nm (OC-NLC), zeta potential from -54,6 mV (OG-NLC) to -60,1 mV (OC-NLC) and PDI < 0,3. The evaluation of long-term stability during six months showed that for empty NLCs, the particle size decreased approximately from 5% (OR-NLC) to 42% (OC-NLC), except for OG-NLC, for which was observed an increase of 20%. Subsequently, NLCs were formulated with 0,5% QT incorporated (QTNLCs), which after six months presented an average particle size that varied between 170 ± 3,4 nm and 236 ± 25,6 nm, showing a decrease between 1% (OM-NLC) and 15% (OC-NLC), except for OR-NLCs for which was observed an increase of 2%. The zeta potential was lower than -30 mV, to guarantee good homogeneity and physical stability of the nanoparticles created in the long-term stability. The melting point of the solid lipid was 56,3ºC, for empty NLCs was between 41.86 and 53.24ºC and for QT-NLCs was between 43,36 and 50,25ºC. The melting point for empty and QT-NLCs was lower than the melting point of solid lipid, which demonstrates that all observed NLCs formulations had an amorphous structure. The efficiency of quercetin incorporation varied between 99,90 and 99,99% and the loading capacity between 16.65 and 16,66%, having been found an initial controlled release up to 8 hours, reaching 36% (OG-NLC) of total release up to 72 hours. The encapsulation of QT decreased the cytotoxicity and increased the antioxidant effect of nanocarriers. The study of the antioxidant effect revealed that vegetable oils and free QT maintained the antioxidant activity of the bioactive compound. In the case of NLCs, comparing to the results obtained with QT, a free radical scavenging capacity between 10% and 38% was detected for empty NLCs and between 35 and 67% for QTNLCs. Thus, in general, the systems maintained the functional architecture of QT after its encapsulation, which is shown by the high antioxidant potential obtained. In vitro permeation was also studied in reconstructed human epidermis (RHE) models, and it was found that the formulated NLCs were able to permeate QT and that it was essentially retained in the stratum corneum. A possible release and diffusion of QT through deeper layers of RHE was detected. In conclusion, although it is important to carry out more studies to prove the efficacy and safety of the formulated nanosystems, the results obtained in this study constitute suggestive arguments for lipid nanoparticles based on vegetable oils as a promising strategy for the topical delivery of quercetin