Non-invasive sampling and genetic variability, structure, and dynamics of the Barroso region wolf nucleus

Tese de Mestrado, Biologia da Conservação, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO lobo (Canis lupus, Linnaeus 1758) é o carnívoro com maior distribuição geográfica devido ao seu carácter generalista em termos de habitat e dieta. Desta forma, enquanto as condições necessárias à sua subsistência, em termos de abundância de alimento e de refúgio, estavam presentes, a população de lobo-ibérico (Canis lupus signatus, Cabrera 1907) permaneceu estável. A sua extinção em Portugal começou apenas na segunda metade do século XX, como consequência da competição por recursos desencadeada pelo crescimento humano exponencial, que levou à sua perseguição e destruição do seu habitat. Entre 2002 e 2003, foi realizado o primeiro Censo Nacional do Lobo Ibérico, numa parceria entre o Instituto da Conservação da Natureza e o Grupo Lobo, para clarificar a situação da espécie em Portugal. Este estudo revelou a existência de duas subpopulações lupinas, separadas pelo Rio Douro: uma a norte, composta por três núcleos - Peneda/Gerês, Alvão/Padrela e Bragança – e uma a sul. A comparação com o censo do lobo em Espanha, indicou que a população nacional de lobo-ibérico corresponde a, aproximadamente, 20% da população ibérica e que a sua área de presença abrange apenas cerca de 15% da distribuição ibérica total. Desde 1990, o lobo está considerado como “Em perigo” pelo Livro Vermelho dos Vertebrados de Portugal e beneficia de legislação especifica que proíbe a sua morte ou captura e a destruição e deterioração do seu habitat. Assim, a Agência Portuguesa do Ambiente exige o desenvolvimento de um estudo de impacto ambiental para avaliar os potenciais efeitos de qualquer projeto a ser desenvolvido na área de distribuição do lobo, o que se torna ainda mais crucial quando se trata de uma ameaça ainda pouco estudada, como a atividade mineira, cujos impactos nos mamíferos são ainda largamente desconhecidos. Assim, a potencial exploração de uma mina numa região próxima à qual foram previamente identificadas diversas alcateias, que provocaria um aumento de movimento e ruído em toda a área circundante, levanta preocupações relativamente à ameaça que pode constituir para o lobo. O presente trabalho adotou duas abordagens distintas e complementares. Primeiramente, foi desenvolvido um estudo de genética não invasiva para avaliar a situação atual do lobo na área. A amostragem não invasiva (NIS) é reconhecida como uma importante ferramenta para estudos de monitorização e conservação, principalmente quando se trata de espécies raras e elusivas, consideravelmente difíceis de observar diretamente na natureza. Este método de amostragem é vantajoso relativamente a técnicas tradicionais de captura e manuseamento, uma vez que é menos stressante para todos os envolvidos, permite obter grandes tamanhos de amostra com baixos custos, e reduz os comportamentos induzidos por humanos nos animais como consequência da armadilhagem. Neste trabalho, o estudo genético com NIS incluiu análise de mtDNA para identificação da espécie, sexagem com marcadores nos cromossomas sexuais, e um painel de 10 microssatélites para estimar a diversidade genética, estrutura e relações familiares. Posteriormente, o software Maxent foi utilizado para avaliar a adequabilidade do habitat para o lobo. Este programa, baseado no Princípio da Entropia Máxima, é extremamente valioso e tem vindo a tornar-se cada vez mais popular entre os Modelos de Distribuição de Espécies (SDM) uma vez que possui uma capacidade preditiva ao nível da dos modelos de melhor desempenho, utilizando, no entanto, informação incompleta, i.e., apenas dados de presença. Nesta análise foram utilizadas as coordenadas GPS das amostras coletadas e três classes de variáveis ambientais: paisagem, pressão antropogénica e disponibilidade de alimento. Em estudos relacionados com o lobo, os dejetos são o tipo de amostra não-invasiva mais utilizada devido à sua abundância e ubiquidade, resultante da alta mobilidade da espécie e da sua tendência em defecar em locais conspícuos, como trilhos ou cruzamentos. Desta forma, entre Outubro 2020 e Dezembro 2021, foram recolhidos um total de 258 dejetos, dos quais 211 foram identificados como lobos e 44 como cães. Entre os primeiros, 92 foram identificados como de macho e 42 como de fêmea, um rácio sexual desigual frequentemente verificado em populações de lobo com intensa competição por alimento entre indivíduos adultos. Relativamente à análise mitocondrial, a população de caninos domésticos demonstrou uma maior diversidade genética (haplotípica e nucleotídica) que a população de lobo, o que reflete o número reduzido de indivíduos, altamente relacionados, na população lupina, comparativamente ao elevado número e à diversidade de cães. A construção de uma rede de haplótipos com o método Median-Joining demonstrou a clara separação entre os haplótipos de lobo e cão por um número considerável de mutações e a similaridade entre os haplótipos de lobo. A análise de microssatélites produziu taxas de erro semelhantes a outros estudos com amostragem não invasiva, com uma taxa média de erro de 5% (4,2% de allelic dropout e 1.9% de false alleles). As probabilidades de identidade, PID = 1.12 × 10-08 e PID-S = 5,91 × 10-04, permitiram afirmar que o uso de 10 loci assegura a identificação individual entre indivíduos aparentados e não aparentados no dataset. A distribuição de mismatches entre amostras permitiu identificar oito indivíduos distintos, correspondendo a uma ou mais amostras que diferem, no máximo, em dois loci. Todas as amostras de cada indivíduo foram do mesmo sexo, com exceção de uma única amostra, possivelmente erroneamente integrada no seu grupo devido a erros de genotipagem. Verificouse desacordo entre as diferentes estatísticas utilizadas para estimar estrutura genética populacional, indicando uma fraca estrutura. A estimativa do K ótimo foi 3 com os métodos ΔK e ΔFst, 2 com LnP(D), 1 com todas as estatísticas do StructureSelector, e 6 com o software BAPS. Foram identificadas duas alcateias, similares às reportadas no censo do lobo de 2002-2003, com um número desigual de indivíduos. Os coeficientes de parentesco e as relações de pedigree entre indivíduos permitiram distinguir nove grupos familiares, constituídos maioritariamente por relações entre irmãos. A área vital das alcateias não demonstrou qualquer sobreposição com a área da mina. Analogamente, o Maxent indicou que as regiões com alta adequabilidade do habitat são muito limitadas e totalmente externas à concessão mineira. A altitude, a distância à sede de concelho, o uso do solo e a densidade de gado foram as variáveis com maior contribuição para o modelo, sendo assim as variáveis ambientais que mais condicionam a presença do lobo na área de estudo. A altitude revelou também ser a variável com mais informação por si só, um resultado lógico e explicado pela sua correlação com outros fatores tais como menor perturbação humana e maior densidade de gado. O número limitado de amostras e microssatélites permitiu ainda assim realizar diversas análises genéticas e chegar a conclusões plausíveis. Contudo, a robustez dos resultados poderia aumentar com a realização de uma terceira ronda de PCR de microssatélites, algo que não foi possível de concretizar devido ao caráter extremamente moroso do processo. Em qualquer caso, ambas as abordagens aplicadas neste trabalho, NIS e SDM, permitiram concluir que a exploração da mina não representa uma ameaça à presença do lobo, pois situa-se num local que não abrange o que se supõe serem as áreas vitais das alcateias identificadas, que não aparentam ter sofrido alterações significativas nos últimos 20 anos. Contudo, a continuidade de monitorização, durante o período de exploração da mina e o de recuperação ambiental da área, deve ser mantida de formar a identificar possíveis impactos na população lupina e a auxiliar a tomada de medidas que os eliminem ou minimizem.The Iberian wolf extinction in Portugal began in the second half of the XX century, as a result of the resource competition triggered by the exponential growth of the human population. Since 1990, the wolf is classified as “Endangered” (EN), and it benefits from specific legislation that requires the conduction of an environmental impact study to assess the possible impacts of any potential projects to be developed in its distribution area, which is all the more vital when it comes to a poorly studied threat, such as mining, whose impacts on mammals are still largely unknown. Therefore, the potential construction of a mine in a location where wolf packs have been previously identified raises concerns as to whether it poses a threat to the species. The present work adopted two distinct and complementary approaches. First, a non-invasive genetics study was conducted to uncover the current wolf status in the area, which included mtDNA analysis for species identification, sexing with sex chromosome markers, and a panel of 10 microsatellite loci to estimate genetic diversity, structure, and family relations. Afterward, Maxent was used to assess environmental suitability for wolf presence, using the GPS coordinates of the collected samples and three classes of environmental variables: landscape, anthropic pressure, and food availability. A total of 258 scats were collected in the field from October 2020 to December 2021, out of which 211 were assigned as wolves. Of these, 42 were females and 92 were males. Microsatellite analysis yielded similar error rates to other non-invasive sampling studies, with a mean error rate of 5% (4.2% of allelic dropout and 1.9% of false alleles). There was disagreement between different statistics employed to estimate population genetic structure, indicating weak structure. Two packs, similar to those reported in the 2002-2003 wolf census, were identified, involving nine distinct family groups, mostly consisting of full-sibling relationships. The pack’s home range showed no overlap with the mine area. Similarly, Maxent indicated that high suitability regions were very limited and did not overlap the mine site. The construction of the mine outside the wolf’s vital areas, in a very low suitable habitat area for it to thrive, indicates that it does not seem to represent a threat to the species presence. However, it is highly recommended to maintain monitoring during mine activity and after decommissioning