Defining a non-canonical role for Condensin II in transcription regulation during spermatogenesis

Tese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento , 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA espermatogénese é um processo altamente especializado que engloba todas as etapas desde o início da diferenciação da célula germinal inicial até à individualização do espermatozoide. Devido à sua importância, este processo é altamente conservado entre espécies de organismos com reprodução sexuada. De um modo geral, a espermatogénese começa quando uma célula estaminal da linhagem germinativa inicia a sua diferenciação. Esta dá origem à espermatogónia que passa por uma fase de amplificação, que corresponde a várias rondas de divisão mitótica com citocinese incompleta, no fim das quais surgem os espermatócitos. Estes passam pelas duas divisões da meiose (ambas com citocinese incompleta, também) resultando nos espermatídios (células haplóides) que passam por uma fase de alongamento, seguida de individualização. Os espermatozoides resultantes deste processo são posteriormente encaminhados para fora do testículo, onde são armazenados até à cópula. Dada a natureza delicada deste processo, perturbações que alterem o seu normal decorrer podem ter repercussões significativas na fertilidade. Durante o processo de diferenciação, as células passam por diferentes modificações conformacionais até chegarem ao espermatozoide maduro. A par destas alterações, a cromatina no interior dos seus núcleos vai também passando por uma série de alterações ao longo das diferentes etapas. Existem diversas proteínas envolvidas ao nível nuclear nestas transformações e entre elas encontram-se as condensinas. As condensinas são complexos proteicos conservados, que são amplamente conhecidos pelo seu papel na condensação e segregação de cromossomas. Existem dois destes complexos identificados como Condensina I e Condensina II. Cada complexo é constituído por cinco subunidades das quais duas são partilhadas. Estas são ATPases e pertencem à família de moléculas responsáveis pela manutenção da estrutura dos cromossomas, sendo normalmente designadas por SMC2 e SMC4. As restantes três subunidades são específicas de cada um dos complexos: Cap-H, Cap-D2 e Cap-G constituem a condensina I; Cap-H2, Cap-D3 e Cap-G2 a condensina II. Ambos os complexos possuem funções diferentes, mas complementares. A condensina I atua ao nível da compactação lateral e a condensina II é responsável pela compactação axial. Estudos anteriores demonstram a relevância dos seus papeis nas divisões celulares, principalmente na mitose, a onde a condensina I é fundamental para o correto desenvolver do processo. No entanto, em Drosophila, foi demonstrado que é a condensina II o complexo essencial para a fidelidade meiótica e para a fertilidade masculina. Nas células da linha germinal, a condensina II localiza-se no interior do núcleo, onde na interfase é responsável pelas alterações na organização da cromatina. Na ausência deste complexo funcional a prófase I dos espermatócitos é afetada sendo que deixa de ocorrer a formação dos três territórios cromossómicos. Apesar desta alteração, ao nível da organização da cromatina, as células conseguem prosseguir com a meiose e realizar a posterior citodiferenciação. No entanto, estudos realizados anteriormente reportaram que apesar da conclusão da meiose nestes machos há um aumento significativo dos erros na segregação de cromossomas como, por exemplo, pontes entre cromossomas, não disjunção e atrasos na movimentação (“lagging”), aquando da migração até aos pólos opostos da célula, na anáfase I. Estes defeitos levam ao aumento significativo de alterações na carga cromossómica de cada célula-filha que, por sua vez, culminam no aumento de casos de aneuploidia nos espermatozoides destes machos. Adicionalmente, machos que possuem este complexo com a sua funcionalidade afetada são também reportados como sendo completamente estéreis. Curiosamente, dados de trabalhos anteriores sugerem a possibilidade de existirem funções não canónicas para este complexo proteico na espermatogénese, dado que a correção destes erros de segregação nos mutantes para a condensina II é insuficiente para recuperar a fertilidade masculina perdida. Baseando-nos nestas observações, propomos a hipótese de que a condensina II é também necessária para a regulação da expressão génica durante o desenvolvimento da célula germinal masculina. Com o intuito de testarmos a nossa hipótese, usamos duas linhas de mutantes de drosófila, uma para cada uma das subunidades específicas da condensina II (Cap-H2 e Cap-D3). Inicialmente, procedemos com um conjunto de análises com o propósito de confirmar que estas linhas de mutantes recapitulavam os fenótipos previamente descritos. Usando a análise citológica, confirmamos que os espermatócitos dos mutantes para as duas subunidades não-SMC do complexo de condensina II não formam os territórios cromossómicos observados na meiose, apesar de serem capazes de completar a meiose e iniciar a citodiferenciação pós-meiótica. Adicionalmente, observamos que a citodiferenciação é prematuramente interrompida nestes mutantes na última etapa da espermatogénese – a individualização. A individualização, como o nome indica consiste na separação dos espermatídios-irmãos através da quebra das pontes citoplasmáticas existentes entre eles e na formação de uma membrana individualizada. São os complexos de individualização que levam a cabo esta função. Estes consistem em cones de actina que se formam em torno do DNA destas células (o que será a futura “cabeça” do espermatozoide), e se movem sincronizadamente através do seu axonema individualizando-as à medida que avançam. A interrupção desta etapa, acaba por contribuir para a esterilidade masculina dado que há uma redução significativa no número de espermatozoides produzidos por estes machos. Para testarmos diretamente a condensina II para um potencial papel na expressão génica, realizamos uma análise da mesma recorrendo à técnica de RNAseq em testículos dos mutantes Cap-D3. Esta análise, por sua vez, revelou que a ausência de CAP-D3 afeta consideravelmente a expressão de 563 genes (239 sobre- e 324 sub-expressos). Foram selecionados para testes funcionais 36 genes, que tiveram a sua expressão mais significativamente reduzida. Usamos linhas RNAi cruzadas com um driver meiótico específico das células germinais (driver: bam-GAL4) e procedemos à realização de quatro rondas independentes de testes de fertilidade. Esta análise revelou que a remoção de um destes genes (Ogre) cuja expressão foi significativamente reduzida, recapitula a infertilidade e o fenótipo testicular observado nos mutantes para a condensina II. Ogre (de seu nome gânglio ótico reduzido) é um gene pertencente à família das inexinas, proteínas que estão envolvidas na formação de junções comunicantes. Na literatura existem referências a fenótipos resultantes da ausência deste gene, mas nenhum associado à fertilidade. Posteriormente, averiguamos se os machos, em que este gene se encontrava silenciado, apresentavam uma redução significa no número de espermatozoides como tinha sido anteriormente observado nas linhas mutantes. Após, percebermos que o mesmo era replicado por estes machos vimos ainda que em ambos os casos, o silenciar da expressão resulta em defeitos significativos na capacidade da célula construir e manter os complexos pós-meióticos de individualização de espermatozoides. Quando olhamos para os nossos dados como um todo, vemos que na ausência de condensina II tanto a organização da cromatina como a expressão génica são afetadas. Esta alteração leva à diminuição da capacidade de as células conseguirem formar complexos de individualização que, por sua vez, culmina na diminuição da produção de espermatozoides. O gene Ogre parece ter um papel importante neste processo, já que junções comunicantes são essenciais para assegurar uma comunicação celular adequada na espermatogénese. Os nossos dados mostram assim que, em Drosophila, a condensina II é também essencial para a regulação da expressão génica durante a espermatogénese. Mais especificamente, a transcrição mediada pela Condensina II é necessária para a correta diferenciação das células germinais pós-meióticas em espermatozoides, demonstrando assim, uma nova função para este complexo proteico na fertilidade masculina. Em suma, propomos que a diminuição da produção de espermatozoides em conjunto com a aneuploidia anteriormente documentada contribuem ativamente para a esterilidade observada nestes mutantes.Condensins are conserved protein complexes that are mainly recognized for their role in chromosome condensation and segregation. In Drosophila, previous studies have shown that Condensin II is essential for meiotic fidelity and male fertility. However, data from previous work in the lab suggest noncanonical roles for this protein complex in spermatogenesis, as rescuing the chromosome segregation defects of Condensin II mutants is insufficient to restore male fertility. Based on these observations, the current thesis work builds on the hypothesis that Condensin II is also required for the regulation of gene expression during male germ cell development. Using cytological analysis, we confirmed that spermatocytes from mutants for the two non-SMC subunits of the Condensin II complex (CAP-D3 and CAP-H2) do not form the meiotic chromosome territories, despite being able to complete meiosis and initiate post-meiotic cytodifferentiation. We observed that cytodifferentiation was prematurely disrupted in these mutants, ultimately contributing to male sterility due to significantly reduced sperm counts. To directly test for a potential role in gene expression, we used RNA-seq of CAP-D3 mutant testes, revealing that the absence of Cap-D3 strongly affects the expression of 563 genes (239 up- and 324 down-regulated). 36 strongly downregulated genes were selected for functional testing using germ cell-specific RNAi (driver: bam-GAL4). This analysis revealed that the depletion of one of these downregulated genes - Ogre - recapitulated infertility and the testicular phenotype of the Condensin II mutants. In both cases, the silencing resulted in significant defects in the assembly and maintenance of the post-meiotic sperm individualization complexes. Our data show that, in Drosophila, Condensin II is also essential for gene expression regulation during spermatogenesis. More specifically, Condensin II-mediated transcription is required for the correct differentiation of post-meiotic germ cells into mature sperm, thus uncovering a new function of this protein complex in male fertility