Modelling Rett syndrome with 3D cardiac models derived from patient-specific human induced pluripotent stem cells

Tese de Mestrado, Engenharia Biomédica e Biofísica, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA Síndrome de Rett (RTT) é uma perturbação rara do neurodesenvolvimento causada maioritariamente por mutações no gene que codifica a proteína MeCP2, localizado no cromossoma X. Embora seja uma doença genética, as mutações que causam a RTT são praticamente todas esporádicas, com menos de 1% dos casos sendo hereditários. A incidência da RTT é mais elevada em indivíduos do sexo feminino, aproximadamente 91% dos casos reportados, afetando cerca de 1 em cada 10 000 a 23 000 mulheres mundialmente. Estes doentes podem apresentar uma ampla gama de sintomas, determinados pela localização, tipo e gravidade da mutação, ou, no caso dos indivíduos do sexo feminino, também pela inativação do cromossoma X. A doença progride em quatro fases e resulta principalmente em perturbações graves do desenvolvimento e função cerebrais, mas também numa miríade de problemas não neurológicos, nomeadamente anormalidades cardíacas, respiratórias, gastrointestinais, metabólicas e ósseas. Efetivamente, quase todos os aspetos da vida destes doentes são afetados, desde a sua capacidade de falar, andar, comer e até de respirar normalmente. Dada a gravidade dos sintomas, a expectativa de vida das pessoas com RTT é reduzida, havendo uma maior incidência de morte súbita, cerca de 26% das mortes. Tem-se especulado que o intervalo QT corrigido (QTc) prolongado, um parâmetro que representa um prolongamento da repolarização cardíaca, poderá potenciar estas mortes súbitas verificadas nos doentes RTT. Apesar desta conexão, ainda é desconhecido se um intervalo QTc prolongado nestas pessoas será um efeito direto da doença no coração ou um efeito secundário das manifestações do sistema nervoso. Dada a raridade e a natureza multissistémica da RTT, a modelação com precisão dos fenótipos associados a esta doença, assim como o desenvolvimento de terapias para estes doentes, tem provado ser desafiante. Os modelos animais têm contribuído significativamente para a superação destas limitações. No entanto, a sua relevância clínica é afetada pelas diferenças entre espécies e a diversidade de fenótipos entre doentes dificilmente pode ser modelada usando essas estratégias. Mais recentemente, as características das células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), nomeadamente a sua capacidade de autorrenovação e o seu potencial para se diferenciarem em qualquer tipo de célula do corpo humano, têm despertado um entusiasmo geral para o desenvolvimento de novos modelos de doenças humanas. De facto, com o aumento do conhecimento sobre este tipo de células, as hPSCs têm surgido como uma alternativa promissora para o estudo da RTT, através de modelos alternativos que mimetizam com maior precisão a gravidade e as características da doença. Uma vez que as mutações no MeCP2 afetam especialmente diferentes estágios de desenvolvimento e função cerebrais, independentemente do tipo de modelo utilizado, as anormalidades neurológicas têm sido a componente da doença mais investigada. Por outro lado, muito poucos estudos recapitulam a RTT noutros órgãos afetados, como o coração. Neste contexto, apenas modelos animais, maioritariamente de murganho, têm sido utilizados para o estudo da componente cardíaca da RTT até à data. Desta forma, este projeto teve como objetivo modelar, pela primeira vez, a RTT com modelos cardíacos 3D derivados de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs) específicas de doentes, assim como identificar alterações derivadas da doença que pudessem contribuir para fornecer novos alvos para estratégias terapêuticas para a RTT. Para tal, o estudo foi dividido em duas partes principais. A primeira parte teve como objetivo estudar as alterações derivadas da RTT no processo de diferenciação cardíaca, após otimização da diferenciação de hiPSCs em cardiomiócitos (CMs) como agregados 3D, usando tanto linhas celulares mutadas como saudáveis. A segunda parte centrou-se no estudo de alterações morfológicas dos agregados de CMs derivados de hiPSCs RTT, tendo-se explorado as diferenças na arquitetura estrutural e composição celular dos agregados 3D de CMs. Para além destes aspetos de organização macroestrutural, foram também estudadas as alterações microestruturais dos sarcómeros dos CMs. Em primeiro lugar, demonstrou-se ser possível diferenciar com sucesso hiPSCs RTT e saudáveis em CMs como agregados 3D. A otimização do processo de diferenciação cardíaca para cada linha celular foi realizada através da variação de dois parâmetros, nomeadamente do tamanho do agregado no início da diferenciação e da concentração da molécula de baixo peso molecular CHIR99021, modeladora da via de sinalização wingless integrated (Wnt). Os resultados obtidos sugerem que esses parâmetros variam dependentemente da linha celular e não são um parâmetro de distinção entre linhas celulares RTT e saudáveis. No entanto, foi possível observar alterações derivadas da RTT nesses agregados 3D de CMs, incluindo diferenças no tamanho e grau de compactação dos agregados, sendo estes maior e menor, respetivamente, nos agregados RTT. Em segundo lugar, os agregados 3D de CMs derivados de hiPSCs RTT foram estudados face aos agregados derivados de hiPSCs saudáveis, tendo-se avaliado a sua morfologia, bem como a estrutura dos sarcómeros dos CMs. Além de CMs, outros tipos de células cardíacas naturalmente presentes in vivo no coração humano também foram encontrados em minoria nos agregados diferenciados RTT e saudáveis, incluindo células endoteliais e uma subpopulação de células progenitoras cardíacas. Tanto a caracterização das cavidades dos agregados como a dos sarcómeros dos CMs revelou alterações morfológicas dos agregados RTT comparativamente aos saudáveis. Os nossos resultados evidenciaram uma percentagem muito maior da área dos agregados RTT ocupada por cavidades, comparativamente com os controlos, não estando relacionada com o número de cavidades por agregado, parâmetro que foi semelhante entre as condições. Verificou-se ainda uma variação na proporção de cavidades de acordo com o seu tamanho entre agregados RTT e saudáveis, com os agregados RTT a apresentarem uma maior proporção de cavidades de maiores dimensões. Foi possível demonstrar que estas disparidades encontradas entre as cavidades dos agregados RTT e saudáveis não foram causadas por diferenças na proliferação dos CMs. Este trabalho sugeriu ainda a existência de um comprometimento estrutural dos sarcómeros dos CMs RTT, tendo-se verificado uma menor densidade de miofibrilhas, que se encontravam mais pronunciadas perto do núcleo dos CMs, assim como um comprimento menor dos sarcómeros, comparativamente com CMs saudáveis. Futuramente, para além de mais replicados, será também fundamental utilizar linhas celulares adicionais nas experiências, incluindo linhas hiPSCs derivadas de doentes com mutações associadas à RTT diferentes, para a validação dos nossos resultados. Além disso, será necessário continuar a análise das alterações derivadas da RTT nos agregados de CMs, nomeadamente para melhor compreender os mecanismos associados às alterações morfológicas dos agregados, bem como às anomalias estruturais dos CMs RTT. O processo de diferenciação cardíaca a partir de hiPSCs RTT e saudáveis deverá ser caracterizado nomeadamente em termos de níveis de expressão génica dos principais genes envolvidos quer na diferenciação cardíaca a partir de hPSCs, quer na maturação dos CMs. Relativamente à análise morfológica das cavidades dos agregados, será interessante avaliar, entre outros, o nível de expressão de HAND1 em agregados RTT e saudáveis, já que foi sugerido anteriormente a sua necessidade para a auto-organização estrutural. Adicionalmente, para complementar o estudo da formação das cavidades dos agregados, deverá ser realizado um ensaio de imunomarcação para o marcador apoptótico CASPASE, de forma a compreender se a morte celular poderá ser um mecanismo associado à formação das cavidades. Por outro lado, será relevante avaliar as alterações funcionais nos agregados RTT. Através de uma análise do transiente de cálcio intracelular, deverão ser estimados parâmetros como a duração da contração e frequência cardíaca, tanto em condições padrão, como sob exposição a estimulação elétrica e química. No entanto, a cultura de CMs por si só pode não permitir observar as anormalidades funcionais cardíacas já descritas em humanos. Assim sendo, uma vez que os CMs e os neurónios sofrem comaturação durante a inervação do coração na embriogénese, o estudo das interações entre estes tipos celulares é essencial, principalmente na modelação de doenças multissistémicas como esta. Por este motivo, numa outra fase, seria interessante co-cultivar CMs e neurónios do sistema nervoso autónomo, ambos derivados de hiPSCs. Esta abordagem permitiria captar potenciais alterações funcionais dos CMs RTT promovidas pelos neurónios RTT e desvendar informações sobre uma potencial interferência anormal entre essas duas populações celulares que, até à data, permanecem desconhecidas. Adicionalmente, seria também relevante recriar a heterogeneidade de células cardíacas presentes no coração humano, através da geração quer de um microtecido cardíaco, quer de um organoide. Para além de possivelmente possibilitarem o estudo da maturação celular e da função geral dos CMs em comparação com o modelo saudável mais simples, permitiriam compreender se as principais etapas que ocorrem durante o processo de desenvolvimento cardíaco na embriogénese, a forma como as diferentes populações celulares são especificadas e a função dos CMs são ou não afetadas pela RTT. Posteriormente, estes modelos poderiam ser ainda co-cultivados com neurónios, estabelecendo um modelo neuro-cardíaco 3D complexo para o estudo desta doença.Rett syndrome (RTT) is a severe neurodevelopmental disorder caused by MeCP2 mutations, resulting mainly in impaired brain development and function, but also in a myriad of non-neurological problems, including cardiac abnormalities. Given the RTT multifaceted nature, it has been challenging to accurately model the associated phenotypes and to develop therapies. RTT models mostly focus on the neurological abnormalities, with few mimicking the cardiac problems. To date, only animal models have been used to study the disease in the heart, but these do not faithfully mimic the phenotypic aspects found in patients. Therefore, we developed, to the best of our knowledge, the first 3D cardiac model of RTT derived from patient-specific human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). RTT and healthy hiPSCs were successfully differentiated into cardiomyocytes (CMs) as 3D aggregates. However, RTT-derived alterations in these CM aggregates were verified, including differences in their size and compaction degree, being higher and lower in the RTT aggregates, respectively. Moreover, the characterization of the aggregate cavities and CM sarcomeres revealed differences between conditions. A higher percentage of the RTT aggregate area was occupied by cavities, which was unrelated to the number of cavities/aggregate, and the cavities presented a variable size. This disparity between conditions was not driven by CM proliferation differences. Furthermore, RTT CMs presented sarcomere structural impairment, with a lower density of myofibril, the presence of which was more pronounced near the CM nucleus, and a shorter sarcomere length. Subsequently, the analysis of RTT-derived changes to the CM aggregates will be continued, namely to elucidate the mechanisms associated to the morphological alterations of the aggregates, and the structural abnormalities of RTT CMs. Moreover, it will be fundamental to study potential RTT-derived CM functional alterations. Additionally, co-culturing CMs with neurons, and recreating the heterogeneity of cardiac cells present in the human heart with a cardiac microtissue and organoid, would be crucial