Investigação epidemiológica, análise histopatológica, análise imunohistoquímica e genotipagem de Toxoplasma gondii em ovinos

O ovino é importante para geração de renda e sustento social. A toxoplasmose é a principal doença reprodutiva nesta espécie. Além disso, os ovinos são importantes no ciclo zoonótico da doença. O objetivo principal deste estudo foi determinar o comportamento da toxoplasmose em ovinos de uma área endêmica para toxoplasmose humana no noroeste do Rio Grande do Sul (RS) por meio da soroepidemiologia, histopatologia, imuno-histoquímica e genotipagem. O controle sanitário é essencial para melhorar a eficiência produtiva nos rebanhos ovinos. No Capítulo 1 desta tese foi realizada a caracterização soroepidemiológica de patógenos reprodutivos. Foram coletadas amostras de sangue de 319 ovinos provenientes de 14 propriedades rurais de 10 municipios do noroeste do RS. A prevalência de Toxoplasma gondii foi de 70,2% (224/319) no MAT, Neospora caninum 20,3% (61/300) na RIF e Leptospira spp. 5,6% (18/319) no MAT em rebanhos comerciais de ovinos localizados na mesorregião noroeste do Rio Grande do Sul. No Capítulo 2 foi realizada a identificação de Toxoplasma gondii em ovinos abatidos para o consumo humano em abatedouros da mesma região. Anticorpos anti-T. gondii foram observados em 22,1 % (32/145) no MAT das amostras de soro de ovinos. A histopatologia e imuno-histoquímica foram analisadas a partir dos tecidos (cérebro, coração e diafragma) dos ovinos soropositivos. As principais lesões observadas foram caracterizadas como microgliose cerebral associada à malácia, nódulo glial e encefalite necrotizante perivascular. Foram identificadas 50% (16/32) das amostras contendo cistos de T. gondii em pelo menos um tecido de cada animal. A imunoreatividade foi observada na meninge (1/16), diafragma (11/16), coração (14/16) e ao redor de vasos sanguíneos e um animal foi positivo na PCR. No Capítulo 3 foi realizado a caracterização genética de um isolado de T. gondii. Foram coletadas amostras de soro e tecidos de 38 ovinos provenientes de abatedouro do município Marau, RS. Após triagem sorológica três foram positivos (título MAT 1:25). De forma complementar, amostras de tecidos de um ovino oriundo de uma fazenda da mesma região e com título 1:800 também foram analisadas. Os tecidos dos quatro ovinos foram submetidos à prova biológica em camundongos. Um isolado foi obtido do tecido do músculo da coxa do ovino de título 1:800. Após o isolamento do parasito, o macerado do tecido de cérebro de camundongos, que foram observados cistos, foi inoculado em células VERO (células de rim de macaco verde africano). O isolado foi propagado na cultura de células com a observação do ciclo lítico 29 dias após a infecção. O DNA foi extraído do macerado do tecido cerebral e do lavado peritoneal dos camundongos e das amostras de cultura. Após a extração de DNA e PCR convencional, o DNA dos isolados foi amplificado em nested-PCR (nPCR) para 11 marcadores moleculares: SAG1, SAG2 (5’+3’SAG2), SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, alt. SAG2 e Apico. Este isolado foi denominado TgOvBrRs6, o qual apresentou genótipo não arquetípico, que não havia sido descrito anteriormente no Brasil. Assim, foi confirmada a diversidade genética deste parasito na região estudada. No Capítulo 4 desta tese foram desenvolvidos protocolos informativos com orientações de prevenção da toxoplasmose em ovinos como uma ação de extensão para a comunidade. A realização desta tese foi ampla e relevante pois abordou a epidemiologia, parasitologia e patologia da toxoplasmose em ovinos em uma região endêmica para toxoplasmose humana e animal.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorFundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de JaneiroSheep are important for income generation and social support. Toxoplasmosis is the main reproductive disease in this species. In addition, sheep are important in the zoonotic cycle of the disease. The main objective of this study was to determine the behavior of toxoplasmosis in sheep from an endemic area for human toxoplasmosis in the northwest of Rio Grande do Sul (RS) through seroepidemiology, histopathology, immunohistochemistry, and genotyping. Health control is essential to improve productive efficiency in sheep herds. In Chapter 1, a seroepidemiological characterization of reproductive pathogens was carried out. Blood samples were collected from 319 sheep that reached 14 rural properties in 10 municipalities in the northwest of RS. The prevalence of Toxoplasma gondii was 70.2% (224/319) in MAT, Neospora caninum 20.3% (61/300) in RIF and Leptospira spp. 5.6% (18/319) not MAT in commercial flocks of sheep that follow in the northwest region of RS. In Chapter 2, Toxoplasma gondii was identified in sheep slaughtered for human consumption in slaughterhouses in the same region. Anti-T. gondii antibodies were observed in 22.1% (32/145) in MAT of sheep serum. Histopathology and immunohistochemistry were analyzed from the tissues (brain, heart, and diaphragm) of seropositive sheep. The main lesions observed were characterized as cerebral microgliosis associated with malacia, glial scarring and perivascular necrotizing encephalitis. 50% (16/32) of the samples containing T. gondii cysts were identified in less than one tissue of each animal. Immunoreactivity was observed in the meninges (1/16), diaphragms (11/16), heart (14/16) and around blood vessels and one animal was positive for PCR. In Chapter 3 it was carried out the genetic characterization of a T. gondii isolate. Serum and tissue samples were collected from 38 sheep from slaughterhouses in the municipality of Marau, RS. After serological screening, three were positive (MAT 1:25 title). In addition, tissue samples from a sheep (MAT 1:800 title) from a farm in the same region were also analyzed. The tissues of the four sheep were subjected to biological testing in mice. An isolate was obtained from the thigh muscle tissue of the 1: 800 titer sheep. After parasite isolation, macerate brain tissue from mouse, which were observed cysts, was inoculated into VERO cells (African green monkey kidney cells). The isolate was propagated in cell culture with the observation of the lytic cycle 29 days after infection. DNA was extracted from macerate brain tissue and from the peritoneal lavage of the mice and culture samples. After DNA extraction and conventional PCR, the DNA of the isolates was amplified in nested-PCR (nPCR) to 11 molecular markers: SAG1, SAG2 (5 '+ 3'SAG2), SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29 -2, L358, PK1, alt. SAG2 and Apico. This isolate was named TgOvBrRs6, which had a non-archetypal genotype, which had not been previously described in Brazil. Thus, the genetic diversity of this parasite in the studied region was confirmed. In Chapter 4 of this thesis, information protocols were developed with guidelines for the prevention of toxoplasmosis in sheep as an extension action for the community. This thesis was broad and relevant because it addressed the epidemiology, parasitology, and pathology of toxoplasmosis in sheep in an endemic region for human and animal toxoplasmosis.170 f